| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
ESI-MC(Q). Олигонуклеотиды. >>>
|
 |
| Автор | Тема: ESI-MC(Q). Олигонуклеотиды. | |||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
 25.02.2010 // 14:54:22
Редактировано 1 раз(а) В разных "позах" пробовал - никак. Олигонуклеотиды синтезированные, проверенные, концентрации "приличные". 4000-5000Да. Буду благодарен за "вектор" (сам ничего толкового не нашел), а так же за советы тех, кто имел дело... |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
25.02.2010 // 18:47:29
А как делали? - если напишите детали тогда легче будет что то подсказать. Проблему понимаю, бывает намучаешься пока что то внятное запишется Навскидку, негативная мода, 1% аммиак (долго не держать), обессоливать перед анализом обязательно. Нормально работают RP сорбенты на полимерной основе, типа Poros, что-ли. Если работаете на тандем масс спектрометре, можете попробовать precursor ion scan for m/z 79: это просто маленький трюк, позволяет убить шум. Удачи! |
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
25.02.2010 // 21:51:11
Спасибо за отклик. Да, пост для экстрасенсов получился. Суть задачи - мол. вес и "чистота", поэтому сначала делал прямую инфузию (скан) (waters quattro micro QqQ и т.д.) раствора синтезированных и "проверенных" олигонуклеотидов с известной массой. Соединения в водном растворе с небольшим содержанием МеСN (10%, поднимал до 30%), насчет "солей" и прочего "добра" я "напряг" людей сразу. Концентрации - какие мне угодно, практически. Пробовал и в - и в + (+HCOOH). С условиями "играл" (творческий процесс, поэтому в точности не описАть ...), конечно, но ничего внятного не получил. С аммиаком попробую, почему то это в голову не пришло. |
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
26.02.2010 // 3:25:59
Никому (!) не верьте насчет солей - синтетики понятия не имеют что у них там делается, их это просто не волнует. Вообще с олигов очень, очень трудно соли содрать, мы даже краун-эфир добавлять пробовали от отчаяния. Какую бы "чистую" пробу вам не дали, обессоливайте сами, сделайте мален-кий катридж (есть тысяча способов), и обессоливайте. Вроде помогало если посаженный на обращенку олиг мыть не водой, а 10 мМ ацетатом аммония (мы даже 100мМ брали, потом водой домывали). Да, еще был такой экзотический совет, но по в моих руках не сработало. Олиг соленый, поэтому чтобы такую гадость пылить надо задирать напряжение на капилляре из которого пылите и в отрицательной моде корона получается на раз. Рекомендовали дуть туда кислородом так чтобы держать довольно в высокие вольты и без короны. Тероретически грамотно, но практически ерунда, по крайней мере у меня не сработало. |
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
26.02.2010 // 12:14:11
Да. Сегодня устроил допрос с пристрастием - да, дело, наиболее вероятно, в "солях". Я уже продумываю стратегию "очистки от солей"-думаю, прямо на ВЭЖХ (ОФ на С18 или HILIC на силикагеле), так же попробую эксклюзионнкой, но эксклюзией (молекулярной) - скорее нет, чем да. Спасибо за советы насчет "отмывки". Насчет экзотики - напряжение поднимал, но "воздух" не дул. |
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
26.02.2010 // 15:28:55
С ВЭЖХ олигов без ион-парного реагента у меня были проблемы, а реагент убивал масс-спек. Поэтому обессоливание на самодельном обратно-фазном полимерном картридже с Poros R3 or R2 сработало лучше всего. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
26.02.2010 // 17:54:24
Значит начну с гидрофильной, насчет он-лайн очистки. В офф-лайне - начну с эксклюзионки, Poros "под рукой" нет, но есть чем заменить. Главное теперь понятно, куда двигаться. На следующей неделе "поткатят" олиги... Если внятное что-то получится - напишу здесь. Еще раз спасибо. |
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
26.02.2010 // 20:52:07
Именно Poros и не нужен, просто у меня он как раз был под рукой. Да, забыл сказать (хотя и так понятно, наверное): смывал малым обьемом 1% аммиака в 60% метанола и сразу без высушивания / перерастворения в масс спек на direct infusion. Иногда нужно было еще разбавить. Олиги молекулы довольно прочные поэтому in source fragmentation (orifice fragmentation), или как она называется на вашей машине, рекомендую усилить чтобы убрать кластеры. Да, и всегда полезно взять в начале хорошую аликвоту которая работает, "посолить" или добавить какой то поганый ион парный катион и посмотреть удачно ли вы отмываетесь. Потом идти на реальные образцы. Удачи! Дайте знать, как пойдет дело. |
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
01.03.2010 // 19:28:37
Редактировано 2 раз(а) Олиги принесли:6500-8000Да. 1. Гидрофильная на силикагеле - не идет, узкие поры. Олиги вылетают в мертвом объеме. (Силикагеля с более широкими порами под рукой - нет) 2. Эксклюзионка на сефадексе G-25 с exclusion limit 4000 Da (PD SpinTrap G-25 от GE - мини патрончики для центрифугирования, были под рукой) - два способа (состав элюента, +МеOH,+NH3) - нулевой результат. Теперь буду пробовать "отмывать" на полистироле "по рецепту". Еще "мысли бегают" возле анионообменника. |
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
01.03.2010 // 23:55:45
Если это так и олиги вылетают в исключенном об'еме, они же должны быть обессолены?! По идее, соберите передний фронт / максимум пика, и будет вам счастье?! Но что то мне подсказывает что что то тут не так.
Вот это интересно. Не прокомментируете, что именно значит "нулевой результат": олиги не вышли (оптическую плотеность "не собрали"); или олиги вышли, но на МС частокол пиков (или вообще пиков нет).
Если полистирол для вас сорбент новый, я бы попробовал посадить смыть и увидить сигнал чего то понятного для начала: гистидин, например (в поз моде, конечно) ил;и лучше чего поотрицательнее. Ну чтобы понять, чем смывать, какой бэкгроунд полезет и т.д. Извиняюсь за тривиальные рекомендации
Посадить не проблема, а вот смывать чем?! |
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
02.03.2010 // 20:07:22
Редактировано 2 раз(а) Почему должны? Я прикидывал, что за 2000-5000 актов сорбции-десорбции с олигов уж точно "все оторвет". Это еще раз доказывает эксперимент на сефадексе (что молекулярная эксклюзия не катит). Мне интуиция подсказывает, что дело, скорее всего, в размере пор (стоит обратить внимание, что в разных хроматографических системах этот параметр влияет по разному, т.е. в ИПХ-(С18)-ВЭЖХ с таким размером пор могло быть все "пучком"). Я соединения с таким мол.массой еще в этом режиме не пробовал, поэтому... С выходом все в норме, рекавери 70-80% (я специально Выше не поднимал, чтобы увеличить разрешение, т.е. эффективность "отмывки", делал уже тремя разными способами, благо быстро), а вот на МС частокол (в "холостой" пробе все "красиво"). Декластеризацию делал, конечно Полистирол полистиролу рознь, но опыт работы есть, с различными. Я взял 30мг Oasis HLB (были под рукой). Откондиционировал. Нанес в воде. Промыл 1%HCOOH (не спрашивайте, почему именно этим и в такой концентрации  ) и затем водой. Смывал MeOH:0.5-1%NH3 aq. (опт. плотность на 260нм не проверял, на nanoview опасно с таким лезть). На МС - то же самое... Буду пробовать еще раз на этом сорбенте, затем на другом, у которого поры шире. Вот вокруг этого мысли и бегали. Есть идея, если дело дойдет. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 24
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
