Форумы ANCHEM.RU: Выбор колонки для гель-фильтрации

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Выбор колонки для гель-фильтрации >>>

  Ответов в этой теме: 16
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Farma
Пользователь
Ранг: 382

20.09.2011 // 15:00:06

Entomo пишет:
насколько мне известно, уравновешивание неполярной колонки ТФУ для последующего смыва градиентом ацетонитрила является разновидностью динамической модификации сорбента. И по сути, превращает неполярный сорбент в полярный. То есть, электростатику получаем. Или я не прав?
Даст ли приобретение катионообменной колонки дополнительные преимущества в таком случае?

В большинстве случаев добавление ТФУ к ОФ фазе всего лишь подавляет ионизацию силанольных групп и/или анионогенных функциональных групп разделяемого вещества. Как ИП реагент ТФУ весьма слаба и ИМХО может считаться таковым с большой натяжкой.
Приобретение CEX колонки позволит получить совершенно иную селективнось разделения.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Farma
Пользователь
Ранг: 382

20.09.2011 // 15:03:08

Entomo пишет:
По поводу HILIC ничего сказать не могу. Там же ведь тот же принцип, что и в ОФ, только не растворителем вымываем из воды, а водой из растворителя. Тоже по степени гидрофобности делит, получается.

Принцип там совершенно иной и селективность тоже может быть совершенно иная. Единственный момент - для высокомолекулярщины метод не очень подходит, больше для мелких молекул.

Entomo
Пользователь
Ранг: 9

21.09.2011 // 11:29:02

Всем огромное спасибо за ответы.

Миллипоровские фильтры мы использовали и используем. Не скажу, что это дешевле, поскольку за один заход приходится тратить по несколько штук. Так, в наборе обычно присутствуют фильтры с НОМ 3, 10, 30 и 100 кДа (это я говорю о наших, Centricon - не знаю, выпускают их еще или нет сейчас). Вот обычно и приходится перебирать от большего к меньшему. В итоге не так уж дешево получается.
Однако, в том случае, когда мы знаем размер молекулы, этот метод, безусловно, годится. Например, в случае антибиотиков насекомых мы знаем, что размер молекул в диапазоне 3-9 кДа. Можно взять 10-ку и через нее прогнать. Мы (точнее - коллеги наши) это делали, правда, не в колонке, а в большой Амиконовской камере для ультрафильтрации. Так вот, скажу, что половина антибиотиков затерялась на пути через фильтр. То ли это связано с тем, что коллеги наши по русскому принципу не используют фильтры однократно, а промывают (не помню в чем) и используют по новой. То ли с тем, что мы исходный раствор плохо посолили (но солить много было нельзя - это уже наши "заморочки").
Но для аналитических целей, когда Вам без разницы потери, главное - концентрирование, наверное, удобно использовать.
Хочется все таки более чувствительный метод для разделения по размеру, чем фильтрация через дырку ЗАДАННОГО размера. И помимо ОТДЕЛЕНИЯ высокомолеулярщины попытаться достичь какого-никакого РАЗДЕЛЕНИЯ мелочи. Пока есть возможность купить на казенные деньги.

Вопрос на тему хроматографии низкого давления: перехода от высокого давления к низкому достигается просто покупкой соответствующей колонки или тушку жидкостного хроматографа надо менять? Вопрос глупый, наверное, но прошу ответить).

Катионообменная хроматография нам подошла бы, например, для тех же антибиотиков, поскольку мы точно знаем, что они катионные. Но в вопросе очистки других молекул, в частности, регуляторных, о которых мы вообще ничего не знаем в большинстве случаев, этот принцип не факт, что подойдет.

HILIC заинтересовал. Начну копать. Одно время уже испытывал необходимость в этом методе, когда целевая молекула выскочила при ТФЭ в гидрофильную фракцию. И ОФ ВЭЖХ ничем помочь не смогла: молекула смывалась еще до добавления растворителя.
Буду благодарен за отзывы о HILIC-колонках. Что посоветуете? У того же Phenomenex-а нашел полупрепаративную колонку LUNA HILIC. Кто-нибудь такую использовал? Есть зарекомендовавшие себя модели? Если кто-то цену их примерную укажет, буду признателен.

Farma
Пользователь
Ранг: 382

21.09.2011 // 13:01:14

Entomo пишет:
Вопрос на тему хроматографии низкого давления: перехода от высокого давления к низкому достигается просто покупкой соответствующей колонки или тушку жидкостного хроматографа надо менять? Вопрос глупый, наверное, но прошу ответить).

Все зависит от задач и формата/масштаба разделения. Тот вариант, который я Вам порекомендовал, можно реализовать в обычной ВЭЖХ системе. Просто вместо колонки ставится картридж с SEC или IEX сорбентом. Какое количество в-ва Вы наносите на колонку?

Entomo пишет:
HILIC заинтересовал. Начну копать. Одно время уже испытывал необходимость в этом методе, когда целевая молекула выскочила при ТФЭ в гидрофильную фракцию. И ОФ ВЭЖХ ничем помочь не смогла: молекула смывалась еще до добавления растворителя.
Буду благодарен за отзывы о HILIC-колонках. Что посоветуете? У того же Phenomenex-а нашел полупрепаративную колонку LUNA HILIC. Кто-нибудь такую использовал? Есть зарекомендовавшие себя модели? Если кто-то цену их примерную укажет, буду признателен.

Формально в HILIC режиме может работать любая нормальная или аминофаза. Но есть и специализированные колонки, например Zic-HILIC от Sequant. Стоимость лучше у дилеров запрашивать.

AA_Alex
Пользователь
Ранг: 372

21.09.2011 // 13:25:37

Entomo пишет:
в наборе обычно присутствуют фильтры с НОМ 3, 10, 30 и 100 кДа (это я говорю о наших, Centricon - не знаю, выпускают их еще или нет сейчас).

Так не надо заказывать набор - можно заказать только то, что надо. У них (Миллипор) сейчас есть удобные центрифужные пробирки на 2мл с вкладышами на 500мкл - как раз под "еппендорфовские" роторы. Мы такими пользуемся, удобно. Если не очень грязные образцы (сначала фугуем на больших оборотах или фильтруем через шприцевые 0,45мкм фильтры от мелкого мусора), то можно использовать несколько раз, главное, чтобы не высыхала мембрана - сразу в воду или буфер.

Entomo пишет: Вопрос на тему хроматографии низкого давления: перехода от высокого давления к низкому достигается просто покупкой соответствующей колонки или тушку жидкостного хроматографа надо менять? Вопрос глупый, наверное, но прошу ответить).

Есть колонки для FPLC, а также пользуем самодельные. В колонку засыпаем нужный сорбент и подключаем ее к обычному ВЭЖХ хроматографу. Еще вариант - берем старые убитые ВЭЖХ колонки и заполняем нужным сорбентом. В основном ионообменные и гидрофобные сорбенты.

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Испытательный центр ВНИИИ мясной промышленности
Основное направление работы - контроль качества и безопасности пищевой продукции, продовольственного сырья, кормов для животных и питьевой воды. Организация и управление работами по испытаниям осуществляются в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий".

Ян
Пользователь
Ранг: 15

21.09.2011 // 14:44:17

Entomo, если Вам нужен параллельный метод для разделения, то первым вариантом я бы рассматривал ионообменную хроматографию.
Разрешающая способность гель-фильтрации в общем случае будет пониже, хотя она и может очень неплохо сработать как промежуточная стадия. Есть момент: белки и пептиды <10kDa могут выходить непредсказуемо, т.к. здесь уже существенную роль играют вторичные сорбционные взаимодействия. Если таковой вклад высок, то иногда это можно использовать с прользой для дела, но, как правило, нет (т.к. м.б. значительное уширение, низкий выход и проч.).

Конкретно по колонке BioSep S-2000: по личным наблюдениям, делит неплохо, но долго живет только в случае слабой нагрузки и 'чистых' образцов. Если Ваши образцы 'грязные', это безусловно не лучший выбор. Вариант - Супердексы (GE Healthcare) - либо 30 (Peptide), либо 75. Разрешение будет похуже, но работать будет удобнее. Можно использовать щелочные буферы, и - важное преимущество - эти колонки можно отмывать от грязи относительно крепкой щелочью.

> перехода от высокого давления к низкому достигается просто покупкой соответствующей колонки или тушку жидкостного хроматографа надо менять?

Менять не надо, но, в зависимости от конструкции насосов, возможно потребуется поставить BPR (клапан - регулятор давления).


Ответов в этой теме: 16 Страница: 1 2 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты