| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Изменение времени удерживания на разных ВЭЖХ колонках одной марки >>>
|
 |
| Автор | Тема: Изменение времени удерживания на разных ВЭЖХ колонках одной марки | |||||
|
optima Пользователь Ранг: 322 |
 23.11.2011 // 13:12:09
Подскажите пожалуйста, в чем может быть проблема. Для анализа использовали гель-фильтрационную колонку. Смотрели чистоту белка. В смесь входит как вспомогательное вещество аминокислота. Как положено, белок всегда выходил раньше, аминокислота позже.Элюент - смесь фосфатного буфера и изопропанола. Купили такую же новую колонку. С тем же элюентом теперь аминокислота выходит раньше белка! Как такое может быть? |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
23.11.2011 // 23:39:15
давайте все: картинки, условия (элюент, температура, скорость), колонку, габариты, химию ее фазы.. желательно привести и последовательность эксперимента.. как установили что точно тот самый белок и что это та самая кислота? сравнили ли градуировку по стандартам на старой и новой колонках? и что такого произошло со старой? |
|||||
|
optima Пользователь Ранг: 322 |
24.11.2011 // 12:50:42
Редактировано 1 раз(а) Уважаемый Константин, Спасибо, что откликнулись. Извините за излишнюю лапидарность в вопросе. Колонка Zorbax GF-250, гидрофильная. Делит белки от 4 000 до 400 000 Да. Исследуемая аминокислота – глицин, мол.м. 75 Да. Исследуемый белок около 22 000 Да. При использовании 0.025 М фосфатного буфера в смеси с изопропанолом белок вышел позже глицина, а при использовании 0.063 М фосфатного буфера+изопропанол белок вышел раньше глицина. Глицин вышел в одно и то же время. Кололи отдельно смесь белка и глицина, глицин, белок, буфер для разведения. Получается, колонка просто „не видит” глицин? Он для нее слишком мелкий? На старой колонке стало невозможно добиться критерия приемлемости – димеры от мономера слишком плохо отделялись. Но ней и при 0.025 М буфере белок выходил раньше глицина, не говоря уже о 0.063 М. Каюсь, колонку не калибровали – просто работали по фармакопейному методу, все вроде получалось.(( |
|||||
|
Волгин VIP Member Ранг: 1327 |
24.11.2011 // 14:55:38
1. ??? Как это - не видит??? 2. Если Вы не перегружаете колонку белком (или образцом), то Ваш белок, независимо от его геометрической формы (единственно на которую может повлиять изменение концентрации буфера - при прочих равных условиях) просто обязан выходить раньше глицина. На нормально работающей колонке. Следовательно, у Вас происходит адсорбция белка на каких-то активных центрах сорбента, которых быть не должно. Что это - гидроксилы, ионы тяжелых металлов или что-то еще - разбираться не будем. 3. Для проверки этого предположения советую провести тест колонки, который был приложен в паспорте на нее. Если он совпадет с приложенным, тогда придется ломать голову. Если же нет, и у Вас есть доказательства, что Вы сами эту колонку не угробили, можете попробовать повоевать с поставщиком.  4. Если такого желания нет, можно попробовать старый "дедовский" метод улучшения колонки. Прокачайте через нее огромный избыток раствора какого-нибудь пролезающего в поры белка, например бычьего сывороточного альбумина - он, возможно, забьет активные центры (возможно и не забьет...). Далее отмываете от него Вашим элюентом и работаете. PS Да, перед тем как гонять через колонку альбумин можно еще попробовать помыть ее раствором ЭДТА - на случай, если на нее все-таки сели тяжелые металлы, например железо, например из воды элюента. Воду Вы, надеюсь, контролируете? |
|||||
|
optima Пользователь Ранг: 322 |
24.11.2011 // 15:03:35
Редактировано 1 раз(а) Спасибо большое за ответ. То есть, все-таки похоже на проблемы с колонкой? Тестового набора как в паспорте увы нету... Вода у нас Milli Q, обратный осмос. Контролируем по фармакопейным параметрам. Спасибо еще раз. Будем думать... Вариант с БСА, если честно, не очень понятен. Но как я понимаю, это крайние меры? |
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
24.11.2011 // 17:11:45
1. Все перепроверьте, возможно, банальные ошибки (кондиционирование, состав элюента и т.д.). 2. Сравните паспорта колонок. Сорбент не явл. константой, от партии к партии его физ.-хим. свойства меняются, т.е. в пределах "окна", которое определяется технологией производства, контролем качества и т.д. 3. Если в фармстатье прописан 0,063М (если не ошибаюсь, то так и есть) фосфатный буфер и с ним все ОК на новой колонке, то работайте на нем и не заморачивайтесь. 4. Не рекомендую, сейчас, следовать советам ув. Волгина (  ) на предмет ЭДТА, БСА и т.д. Все верно, только всему свое время.5. Нужно тестирование (в соотв. с паспортом), чтобы выявить брак. Брак маловероятен. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
optima Пользователь Ранг: 322 |
24.11.2011 // 17:15:14
Редактировано 1 раз(а) Спасибо за ответ. Кондиционирование - это что? Дело в том, что такое поведение в принципе противоречит смыслу гель-фильтрации - тот, кто крупнее выходит раньше, кто мельче - позже. А тут все наоборот получается. В фармакопее действительно 0,063 М.)))) Но на в таком варианте на новой колонке все вышло практически одновременно - белок и глицин почти не разделились, белок совсем чуть-чуть раньше вышел. То, что это два пика, я поняла, проколов отдельно белок и глицин.(((( |
|||||
|
Волгин VIP Member Ранг: 1327 |
24.11.2011 // 17:18:09
Редактировано 1 раз(а) 1. Конечно крайние! И с ЭДТА - тоже. 2. "Рекомендую сейчас следовать советам ув." virtu! 
|
|||||
|
optima Пользователь Ранг: 322 |
24.11.2011 // 17:24:58
Редактировано 3 раз(а)
|
|||||
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
24.11.2011 // 18:19:24
Так, все-таки умудрились не указать соотношение изопропанола и буфера!!!  Вобщем все с этим случаем ясно. Сначала - туториал. Это диольная колонка. Она работает при разделении белков в смешанном режиме: смеси эксклюзии (гель-фильтрации) и адсорбции в режиме HILIC (гидрофильная хроматография). От адсорбата и состава элюента зависит - кто из них пересилит. Чем больше в молекуле полярных групп - тем сильнее ее удерживание по гидрофильному механизму. Удерживание также растет при уменьшении доли воды (буфера) в элюенте и при уменьшении кол-ва соли в буфере. Чем молекула просто больше - тем сильнее ее эксклюзия. Есть нулевое время (нулевой объем). Там выходит все, что НЕ эксклюдируется (то есть заходит во все поры) и НЕ удерживается. Предположим, что глицин как раз выходит в нуле (поскольку от смены условий он никуда не сдвигается). Теперь следите - если белок НЕ удерживается, то он выходит раньше нулевого (и раньше глицина) - потому что он только эксклюдируется (заходит не во все поры, а только большие). Но что случится, если он вдруг начнет удерживаться? Он поползет вправо, постепенно "догонит" лейцин, а потом и "перегонит". Теперь ясно что там происходит? Происходит удерживание белка. Почему? а) Вы уменьшили кол-во соли в элюенте, б) методику писал баран. То есть не настоящий баран, а метафизический. Если бы этот баран прочитал хотя бы мануал по колонке то понял бы, что работать надо на чистом буфере, желательно еще до 40С подняв температуру. Вы видите в мануале где-нибудь упоминание изопропанола? Нет! Раствор 30% изопропанола в воде указано как средство регенерации колонки при прокачке в обратном направлении - и все. Что же делать? Ответ дан в известной рекламе - ПРОСТО ДОБАВЬ ВОДЫ. Необходимо снизить долю изопропанола в буфере, или вообще его по возможности убрать. |
|||||
|
optima Пользователь Ранг: 322 |
 24.11.2011 // 19:18:51
Спасибо! огромное!!! Завтра все попробую. Изопропанол взялся из фармакопеи.((( Исходно было 3% (объемных). |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 33
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
