Форумы ANCHEM.RU: NP-HPLC нейтральных липидов

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

NP-HPLC нейтральных липидов >>>

  Ответов в этой теме: 11
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Автор

Тема: NP-HPLC нейтральных липидов

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

12.07.2016 // 16:51:35

Добрый день! Я снова чешу свой гондурас

Изрядно намучившись с оптимизацией градиента для разделения ТАГ, АсДАГ и СЖК друг от друга, решил снова поискать изократические режимы, и, в общем-то нашёл их, только рефрактометр и ДМД (213 нм +/- 2 нм) рисуют несколько разные хроматограммы:
вот что даёт рефрактометр (полярность +, отклик 0,1 с): https://cloud.mail.ru/public/EUJC/H9k412atS

а вот та же хроматограмма с диодно-матричного: https://cloud.mail.ru/public/8KwT/Anvh3DYba

Заколота смесь растворов подсолнечного масла (источник ТАГ), масла семян бересклета (источник АсДАГ) и СЖК, полученные омылением подсолнечного масла.
На обеих хроматограммах видны все три пика, а время анализа весьма радует, но! Почему рефрактометр рисует двухвершинный пик для АсДАГ (4,364 и 4,894), а ДМД видит его как один с сильным хвостом? И наоборот, перед ТАГ ДМД видит что-то ещё, что, видимо, не является интересующим меня соединением?
Какому детектору стоит доверять?
Можно ли работать, если получаются такие хроматограммы?

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

13.07.2016 // 12:49:39

Редактировано 2 раз(а)

Chamomillablue пишет:
Какому детектору стоит доверять?
Можно ли работать, если получаются такие хроматограммы?

1. Обоим. Принципы детектирования разные, плюс кОлите смесь реальных образцов, поэтому здесь нет ничего удивительного. По-хорошему, надо стандарты использовать. Когда занимался липидами, то все оптимизации и т.д. проводил на тестовых смесях стандартов, это при том, что связка была HPLC-DAD-ELSD-MS.

2. Перед ТАГ в обоих случаях что-то выходит, просто отклики разные. Кстати и пик СЖК тоже "неровный". Рядом с АцДАГ что-то выходит, просто отклик на УФ у него значительно меньше, чем на РД.

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

13.07.2016 // 14:22:12

virtu пишет:
1. Обоим. Принципы детектирования разные, плюс кОлите смесь реальных образцов, поэтому здесь нет ничего удивительного. По-хорошему, надо стандарты использовать. Когда занимался липидами, то все оптимизации и т.д. проводил на тестовых смесях стандартов, это при том, что связка была HPLC-DAD-ELSD-MS.

2. Перед ТАГ в обоих случаях что-то выходит, просто отклики разные. Кстати и пик СЖК тоже "неровный". Рядом с АцДАГ что-то выходит, просто отклик на УФ у него значительно меньше, чем на РД.

стандарты как сферические цыплята в вакууме

догадываюсь, что Диолеоил-3-ацетил-глицерин давал бы один пик, но, во-1, таких стандартов не существует (коммерчески доступных), во-2, в природных маслах дело приходится иметь всегда со смесями молекулярных видов, которые могут мало различаться по массе, но сильно по ненасыщенности

Конечно для калибровки я уже постараюсь купить стандарты, но для отработки метода решил воспользоваться маслами обычными.
вопрос собственно в том, почему рефракторметр видит пик АсДАГ двухвершинным, а ДМД -- с большим хвостом? И можно ли удовлетвориться таким разделением или попробовать ПФ с меньшей элюирующей силой, например, гексан/ацетон, чтобы ТАГ не элюировались так быстро?

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

13.07.2016 // 16:29:20

Редактировано 1 раз(а)

Chamomillablue пишет:
стандарты как сферические цыплята в вакууме

Бесспорно, но на начальных этапах разработки всегда используют именно их, а не образцы, по сути, неизвестного состава. Вы же не знаете, что там и результаты поэтому такие неоднозначные.

Chamomillablue пишет:
вопрос собственно в том, почему рефракторметр видит пик АсДАГ двухвершинным, а ДМД -- с большим хвостом?

Не пик с двумя вершинами, а два пика. Принципы и параметры детектирования разные. Соотв. на УФ второй пик формирует "хвост".

Chamomillablue пишет:
И можно ли удовлетвориться таким разделением или попробовать ПФ с меньшей элюирующей силой, например, гексан/ацетон, чтобы ТАГ не элюировались так быстро?

А как здесь удовлетвориться, когда нет однозначности? Мне, например, непонятно, где у Вас АцДАГи и насколько гомогенны по группе (только ТАГи и т.д.) пики ТАГ, СЖК, АцДАГ. СЖК пик тоже "кривой" (явно 2 пика).

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

13.07.2016 // 16:38:58

virtu пишет:
Бесспорно, но на начальных этапах разработки всегда используют именно их, а не образцы, по сути, неизвестного состава. Вы же не знаете, что там и результаты поэтому такие неоднозначные.

А как здесь удовлетвориться, когда нет однозначности? Мне, например, непонятно, где у Вас АцДАГи и насколько гомогенны по группе (только ТАГи и т.д.) пики ТАГ, СЖК, АцДАГ. СЖК пик тоже "кривой" (явно 2 пика).

Очевидно же, что в подсолнечном масле главным компонентом являются именно ТАГи, поэтому я ориентируюсь на самый жирный пик, на который приходится более 90% от суммы площадей. Думаю, это вполне логично.
АцДАГи я экстрагировал гексаном из семян бересклета, про который давно известно, что до 98% масла состоит из них. Это подтверждено многими исследователями, плюс мы сами в этом убеждались, когда снимали ЯМР. Посему, вполне логично, что если смешать два масла, на хроматограмме будет 2 больших пика.
Но АсДАГи дают две (а при меньших концентрациях ИПС (0,3-0,6% и 4-6) вершины, даже если их предварительно почистить в тонком слое от ТАГ и прочего... с ТАГ такого не возникало, хотя, при элюировании из чистым гексаном, пик выходил многохолмистым.

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

13.07.2016 // 19:28:41

Chamomillablue пишет:
Очевидно же, что в подсолнечном масле главным компонентом являются именно ТАГи, поэтому я ориентируюсь на самый жирный пик, на который приходится более 90% от суммы площадей. Думаю, это вполне логично.

Ага, а технологические и прочие добавки? А примеси? А соединения-контаминанты? А разные отклики детектора? Вы вообще в курсе насколько большой может быть разница в факторах отклика для разных соединений на УФ и РД?

Chamomillablue пишет:
АцДАГи я экстрагировал гексаном из семян бересклета, про который давно известно, что до 98% масла состоит из них. Это подтверждено многими исследователями, плюс мы сами в этом убеждались, когда снимали ЯМР.

Это всё "Сказки Венского леса". Вы абсолютно не знаете полный (скажем, до 0.1%w) качественный и количественный состав своего конечного экстракта.

Chamomillablue пишет:
Посему, вполне логично, что если смешать два масла, на хроматограмме будет 2 больших пика.

Да, только у Вас не два пика. Более того, наличие двух пиков не говорило бы, что один пик - ТАГи, а другой пик, априори - АцДАГи. Это еще нужно доказать. Гомогенность пиков в том числе. Аналитика - это не гадание на кофейной гуще.

Chamomillablue пишет:
Но АсДАГи дают две

Откуда вообще известно, что и где там АцДАГ? Может там один из пиков вообще никакого отношения к АцДАГам не имеет, да и вообще к липидам. Как пики идентифицировались?

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

ФР.1.31.2008.05169 «Методика выполнения измерений массовой концентрации углеводородов (суммарно) в атмосферном воздухе, воздухе рабочей зоны, промышленных выбросах методом ИК-спектрофотометрии на концентратомере КН-2м»
Диапазон измеряемых концентраций от 1 до 500 мг/м3.

[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

13.07.2016 // 22:29:47

virtu пишет:
Это всё "Сказки Венского леса". Вы абсолютно не знаете полный (скажем, до 0.1%w) качественный и количественный состав своего конечного экстракта.

Только я было порадовался прогрессу в своём геморрое, как вы заронили злостные сомнения.
Попробую выделить ТАГи и АцДАГи препаративной ТСХ и заколю их индивидуальные растворы. Если стандарт ТАГов ещё можно купить, что вот АцДАГов -- вряд ли, тем более, чтоб они были не sn1(3)-ацетил-, а строго sn-3, как это в масле бересклета.

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

14.07.2016 // 13:03:00

Chamomillablue пишет:
...как вы заронили злостные сомнения.

Обоснованные сомнения.

Chamomillablue пишет:
Попробую выделить ТАГи и АцДАГи препаративной ТСХ и заколю их индивидуальные растворы.

Беда в том, что гомогенность пятен на ТСХ тоже неизвестна. А учитывая низкое разрешение ТСХ, то совсем не факт, что в выделенном пятне будут только ТАГи и т.д.

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

14.07.2016 // 13:04:26

На мой взгляд, здесь просто необходима масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС).

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

14.07.2016 // 13:37:20

virtu пишет:
На мой взгляд, здесь просто необходима масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС).

Когда он есть, то разумеется, с ним легче жить. Но работаем с тем, что имеем здесь и сейчас.
Справедливости ради хочу отметить, что вся биохимия, которую мы знаем, все её базисы, были созданы без МС. И с появлением МС ни один из её постулатов не был опровергнут. Уточнены или найдены отклонения от стандартных закономерностей. Не более.

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

14.07.2016 // 14:25:06

Chamomillablue пишет:
Справедливости ради хочу отметить, что вся биохимия, которую мы знаем, все её базисы, были созданы без МС.

Верно, только эффективность было значительно меньше, чем сейчас с современными инструментальными методами. И то, на что раньше уходили недели/месяцы/годы, сейчас можно сделать за часы/дни/недели.

Другими словами, стоит признать, что без применения современных методов анализа, нельзя рассчитывать на какую-либо конкурентоспособность.


Ответов в этой теме: 11 Страница: 1 2 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты