| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Регенерация от ПАВ колонки Zorbax GF-250 >>>
|
 |
| Автор | Тема: Регенерация от ПАВ колонки Zorbax GF-250 |
|
Алексей (СамГУ) Пользователь Ранг: 367 |
 24.08.2016 // 18:07:33
Коллеги, возможно кто-то имел подобный опыт. Разделяли белки с добавкой в подвижную фазу ПАВ - лаурилсаркозинат натрия. Потом потребовалось делить белки в ПФ обычных (буфер , соль), перед эти решили хорошо колонку отмыть (вода, вода-изопропанол, 0.1 % ТФУ, от 20-90%) и оказалась , что белки (такие как BSA , OVA т.д.) не элюируются из колонки , т.е. колонка стала белки адсорбировать, хотя любая низкомолекулярная полярщина выходит нормально. Понятно , что причина в ПАВ, и производитель колонки пишет, что если уж вы добавили в ПФ ПАВ такие как SDS, то лучше теперь для таких ПФ ее только и использовать. Конечно, как вариант, это разок промыть колонку 0.1 N NaOH , хотя конечно опасно ... Вобщем перед этим мне хотелось бы услышать ваше экспертное мнение, может кто с таким сталкивался. |
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
24.08.2016 // 23:01:12
Редактировано 1 раз(а) С такой ситуацией (ПАВ и сорбент) никогда не сталкивался, но попробовал бы следующее: 1. MeOH (100%) 2. MeOH/MeCN : 0.2-0.4%v TEA/DEA (триэтиламин/диэтиламин в воде) от 2:1 до 4:1 |
|
Алексей (СамГУ) Пользователь Ранг: 367 |
25.08.2016 // 13:35:05
Спасибо за совет! Попробуем. Пока делали следующие: 1. промывка 20 mM Трис (pH=8), 0.2 M аргинин. Базовая линия плыла, то есть явно с колонки что-то смывалось. Белки сидят прочно на колонке, выходит только B12 2. потом промывка 20 mM Трис (pH=8), 0.2 NaCl. Базовая линия очень стабильная, белки вообще не выходят , зато B12 выходит более симметричным пиком  3. далее мыли мочевина 8М, фосфатный буфер 0.1М (pH=7.5). Появились белки , но не все(!). Правда эффективность колонки не очень. 4. решил законсервировать колонку 0.1 Na2HPO4 (ph=7), 0.005% NaN3. И за одно решил проверить как делится смесь белков ,и О! Чудо! Появились все белки , хотя высота пиков и эффективность разделение желают лучшего. Прогнал 500 мл данной ПФ и еще раз прогнал смесь, обнаружил что колонке продолжает легчать. Просто прогнал белок BSA, выходит! , но эффективность разделения не очень. Смесь белков от Био РАД, Da: Thyroglobulin (bovine) 670,000 γ-globulin (bovine) 158,000 Ovalbumin (chicken) 44,000 Myoglobin (horse) 17,000 Vitamin B12 1,350 Получается , что мочевина рулит !! |
|
AA_Alex Пользователь Ранг: 372 |
26.08.2016 // 7:19:58
Спасибо за совет! Попробуем. Пока делали следующие: 3. далее мыли мочевина 8М, фосфатный буфер 0.1М (pH=7.5). Появились белки , но не все(!). Правда эффективность колонки не очень. 4. решил законсервировать колонку 0.1 Na2HPO4 (ph=7), 0.005% NaN3. И за одно решил проверить как делится смесь белков ,и О! Чудо! Появились все белки , хотя высота пиков и эффективность разделение желают лучшего. Прогнал 500 мл данной ПФ и еще раз прогнал смесь, обнаружил что колонке продолжает легчать. Просто прогнал белок BSA, выходит! , но эффективность разделения не очень. Вообще-то производитель рекомендует: back-flush the column (after reassembly) with 30% isopropanol; 30% isopropanol with 1mM EDTA (pH 4.5); or 50% acetonitrile, containing 0.05% TFA. This last cleaning procedure is quite stringent and may restore column performance. If not, you can assume that the column has been compromised beyond repair. https:// А для хранения ГФ-колонок я использую 0,02 или 0,05% азид (это стандартные рекомендации для ГФ-колонок типа TSK-gel, Bio-Sep и т.п.) |
|
Алексей (СамГУ) Пользователь Ранг: 367 |
29.08.2016 // 10:24:56
Редактировано 2 раз(а) Спасибо за совет! Попробуем. Пока делали следующие: 3. далее мыли мочевина 8М, фосфатный буфер 0.1М (pH=7.5). Появились белки , но не все(!). Правда эффективность колонки не очень. 4. решил законсервировать колонку 0.1 Na2HPO4 (ph=7), 0.005% NaN3. И за одно решил проверить как делится смесь белков ,и О! Чудо! Появились все белки , хотя высота пиков и эффективность разделение желают лучшего. Прогнал 500 мл данной ПФ и еще раз прогнал смесь, обнаружил что колонке продолжает легчать. Просто прогнал белок BSA, выходит! , но эффективность разделения не очень. Вообще-то производитель рекомендует: back-flush the column (after reassembly) with 30% isopropanol; 30% isopropanol with 1mM EDTA (pH 4.5); or 50% acetonitrile, containing 0.05% TFA. This last cleaning procedure is quite stringent and may restore column performance. If not, you can assume that the column has been compromised beyond repair. https:// А для хранения ГФ-колонок я использую 0,02 или 0,05% азид (это стандартные рекомендации для ГФ-колонок типа TSK-gel, Bio-Sep и т.п.) Это, конечно, вы правы. И конечно, инструкция к данной колонке была нами изучена вдоль и поперек ) Но следует заметить, что описанный способ регенерации колонки дан для случая очистки колонки от белков и всего такого , а не от ПАВ, как в моем конкретном случае. Что касается применения ПАВ в ПФ, то в инструкции сурово написано : если уж применили, то теперь только так ее и используйте. И конечно, правильно бы было купить просто 2-е колонки и не парится , но это непросто в условиях российской действительности. Что касается концентрации азида, которую вы используете .. по-моему его концентрация высоковата, рекомендуют 0.005%, т.е. в 10 раз меньше. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 4 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
