31.01.2019 // 3:52:23

---

toxic1978 пишет:
у меня есть опыт определения концентрации белковых веществ в пробе, методом Бретфорда. Правда, было это 15 лет назад - с тех пор работа в другом направлении.

Подтверждаю, реактив (раствор на основе фосфорной кислоты, кумасси R/G 250 и дистиллированной воды) перед использованием надо фильтровать через складчатый бумажный фильтр и обычную воронку, иногда даже 2-3 раза, используя каждый раз новый фильтр. Даже если визуально при первом осмотре взвесей нет. Первоначально, после растворения навески реактива, раствор будет темно-синий, почти черный. Готовый реактив после фильтрации должен быть прозрачный, светло-оливкового или коричневого цвета (субъективно), при смешивании с пробой, содержащей белковые вещества, образовывать раствор, имеющий ярко-синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка. Использовали растворы кумасси G250 и растворы R250 - смотря для чего.

У нас было так: сначала готовили концентрированный раствор кумасси по прописи, его и хранили, а раствор для анализа делали каждый раз перед работой, свежий, методом разбавления концентрированного водой, с фильтрацией. Но это уже может отличаться и является особенностью прописи Вашего метода. Важный нюанс следует уделить приготовлению раствора для градуировки, в нашем случае был обычный яичный альбумин (Сигма/Мерк). Сначала нужно в химический стакан набрать дистиллированную воду, затем аккуратно перенести в нее навеску альбумина, при этом частицы альбумина сразу останутся на поверхности раствора. Главное не перемешивать, стеклянные палочки не опускать, подождать минут 30 для гидратации молекул. Далее с ополосками раствор очень аккуратно переносят в мерную колбу и там доводят до метки, перемешивают методом перевертывания колбы с содержимым, избегая встряхивания - иначе будет пена белка. При ее образовании - ждать естественного оседания, готовый раствор белка не хранить. При наличии мути или опалесценции или ищут другой препарат белка или фильтруют, но затем это учитывают в выводах. При проведении анализа по методу Бретфорда избегают энергичности, т.е. холерики гуляют лесом.

В работе следят за кюветами, пипетками и вообще любой посудой (мы использовали кварцевые, расстояние между гранями 5 мм). Важна их чистота. Для ее соблюдения использовали многократную промывку, хромпик (не уверен уже, но кажется кислоты хорошо отмывали остатки кумасси и тогда он был еще разрешен), сушку в темошкафу (кроме кювет). Все штативы - идеальный чистый пластик и металл. Проверяйте кюветы - должны быть и чистыми и без погрешности более 0,005 ед. абсорбции, при их промывке исключить всё щелочное.

Мы спектр комплекса белка и кумасси по всем длинам волн не снимали, но и калибровка и результаты по одной длине волны, оговоренной в методике, были удовлетворительные всегда (видимая часть спектра, район 650 нм, кажется). Главное анализ, градуировку и выводы делать на одной порции отфильтрованного реактива кумасси. Это ноу-хау этого метода, о котором редко пишут в книгах, в том числе у Бейли. Ну плюс чтобы сама проба перед анализом и ее аликвота, но уже с краской, тоже были прозрачными. Это важно. Если проба мутная, используйте ее фугат и ОДНОРАЗОВЫЕ пробирки эппедорф, из пластика.

Про вещества, которые могут искажать результаты анализа - отдельная тема, и это уже выходит за рамки этой короткой познавательной беседы.

Надеюсь, помог

---

  Ответов в этой теме: 6

Ответ на тему