| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
MS-MS „y „}„Ђ„t„y„†„y„{„p„€„y„‘ >>>
|
 |
| Автор | Тема: MS-MS „y „}„Ђ„t„y„†„y„{„p„€„y„‘ | |||||
|
shure Пользователь Ранг: 17 |
 05.06.2007 // 14:09:21
Редактировано 6 раз(а) привет! я не химик, сразу оговорюсь. Проблема такая - классически белки модифицируют NEM - N-этил малеимидом, который связывается с серой в цистеине. Есть еще вот такой малеимид, к которому приделана флюоресцентная группа - сразу удобно видеть потмо куда он связался. F-NEM:  Есть у нас меченный белок вот етим F-NEMом. для того что бы идентифицировать именно меченый белок оыбчно берут и делают его масспектрометрию. Если белок модифицирован просто NEM, то вроде как все обработки перед масспеком на метку не влияют. Но судя по всему, если ето F-NEM, то на какой-то стадии метка висящая на белке и добавляющая 427Да к массе превращается во что-то другое - ето может быть и химическая модификация во время подготовки образцов Обработка белка в для подготовки к масспеку (идет все при 20С) 1. Ammoniumhydrogencarbonat 200мМ 2. Acetonitril 3. 0.1% Trifluoroacetic acid На подложке для масспека есть ?-cyano-4- hydroxy-cinnamic acid. что может произойти с F-NEM? к тому же при облучении лазером образца с такой меткой, флюоресцеин навернео тоже может разваливаться давая продукты неясной массы, но до сих пор приделанные к белку. не подскажут ли специалисты-химики что может произойти с F-NEM при такой обработке? спасибо |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
05.06.2007 // 15:06:11
Что происходит с меткой точно не знаю, да и вряд ли кто-то уверенно скажет потому что результат зависит от многих обстоятельств. Что бы я сделал чтобы понять что-же происходит: 1. HCCA считается "горячей" матрицей, которая сильно "греет" молекулы аналита и инициирует распад потенциально нестабильных молекул. Перейдите на дегидробензойную кислоту (DHB) и посмотите не будет ли лучше. 2. Запишите тот же спектр в линейной моде (вы наверное для картирования пользуете reflex?). Даже если "в полете" перегретая молекула развалится, ( и масса изменится соответственно), весь компот прилетит в одно время в линейной моде, а в рефлех (грубо говоря) просто исчезнет, если не желаете снимать PSD 3. Возьмите какой нибудь простой синтетический пептид с цистеином, навесьте на него вашу метку и посмотрите в разных вариантах что будет. Простейшим будет, например, восст. форма глутатиона. 4. Ну и, конечно же, почему бы не стрельнуть electrospray? Просто наноспрееем, на прямом вводе в масс спецтрометр, чтобы не заморачиваться с LC. Я так понял вы во Frankfurt'e? Так обратитесь к Michael Karas, лучше него эксперта в MALDI в мире просто нет! |
|||||
|
shure Пользователь Ранг: 17 |
06.06.2007 // 13:10:19
спасибо огромное. проблема что я уже не во франкфурте - там мои бывшие коллеги (именно у караса) анализируют образцы. поетому мне им сложно давать советы, но как-то они без огонька етим занимаются. но я попробую им передать ваши советы. |
|||||
|
shure Пользователь Ранг: 17 |
06.06.2007 // 13:17:34
а не могли бы вы по англ. ето сказать, потмоу ч тоя сам ен спектрометрист и етих приборов видал только один раз. |
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
06.06.2007 // 15:16:43
Редактировано 1 раз(а) Охотно! 2. Запишите тот же спектр в линейной моде (вы наверное для картирования пользуете reflex?). Даже если "в полете" перегретая молекула развалится, ( и масса изменится соответственно), весь компот прилетит в одно время в линейной моде, а в рефлех (грубо говоря) просто исчезнет, если не желаете снимать PSD I have a few trivial suggestions that might help to clarify what’s going on. First, why not acquiring the same spectra (with HCCA or DHB matrix) in linear mode (I guess, you applied reflex mode for peptide mass mapping, or?). Even if, while flying, the excited analyte undergoes some sort of post-source decay, all products will be detected as a single (albeit somewhat broadened) peak whose centroid corresponds to m/z of the intact molecule. Contrary, these species might not be detectable in reflex mode at all, unless you acquire a PSD spectrum 4. Ну и, конечно же, почему бы не стрельнуть electrospray? Просто наноспрееем, на прямом вводе в масс спецтрометр, чтобы не заморачиваться с LC And, of course, if you suspect the UV fluence is a culprit, why not trying out ESI instead? Since the peptide mass is known and the mixture is not expected to be complex, a simple direct infusion experiment (in conventional or nanospray mode) would probably suffice. The exact type of the mass spectrometer does not seem to play a big role, although MS/MS or MS(n) option would help. Но, по жизни, стремно это как то Karas рассказывать, потому как он флуоресцентные метки для MALDI и придумал. Это же классик, несправедливо обделенный Нобелем Кстати, Евгений Московец и Анна Пашкова сделали классную работу у Barry Karger по флуоресцентным меткам в MALDI: Pashkova, A., Moskovets, E., and Karger, B. L. (2004). Coumarin tags for improved analysis of peptides by MALDI-TOF MS and MS/MS. 1. Enhancement in MALDI MS signal intensities. Anal Chem 76, 4550-4557. |
|||||
|
shure Пользователь Ранг: 17 |
06.06.2007 // 17:28:23
Редактировано 1 раз(а) большое спасибо. как станет известно - расскажу чего вышло. с карасом я только раз разговаривал, когда рассказываль что мне собственно надо - а сейчас там етим занимается его постдок один из его лабы и постдок из моей лабы (помимо многих других вещей), но уже год они не могу определить субъединицу ету. спактр есть все есть, но определить не могут. при том что вариантов-то немного - ето из известного почищенного комплекса - всего 8-10 кандидатов. проблема в том, что она верноятно очень гидрофобная, 14-18 кДа, мало фрагментов дает плюс ета заморачивание с модификацией неизвестной массы. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
06.06.2007 // 18:33:55
Редактировано 2 раз(а) Да, это может быть очень непросто: при трипсинилизе такие белки дадут (реально) два -три детектируемых пептида в лучшем случае, и если один самый интенсивный неизвдесто как модифицирован, то поймать его трудно. Вариантов на самом деле немного: - делать nanoLC MS/MS и надеятся подцепить больше пептидов или хотя бы один немодифицированный пептид - а нельзя белок ацетамидом модифицировать, или не модифицировать никак и вырезать полоску (пятно) с геля. По идее, модифицирующая группа не должна сильно менять подвижность - возиться со спектром который есть (например делать с ним error-tolerant searches). Проблема в том что если не понятно как пептид модифицирован, то автоматическая de novo интерпретация будет часто ошибочной Что можно делать если МС/МС спектр хорошего качества это попытаться его интерпретироать (хотя бы частично) руками, получить sequence tags, а потом делать error-tolerant searches with peptide sequence tags уповая на то что органисм вы знаете и мол вес преимерно тоже? Если fragment pattern совсем мутный, можно гидролизовать пятно трипсином в 50% (18)O-воде, тогда хотя бы C-концевые ионы будут видны как характерные дублеты У M.Karas народ все это знает очень хорошо. Если проблемы, спрашивайте, рад буду помочь |
|||||
|
shure Пользователь Ранг: 17 |
07.06.2007 // 14:11:20
Редактировано 1 раз(а) спасиббо. менять методику мечения не получится - есть вот ети метки. конечно можно было- бы вместо FNEM взять радиоактивный какой-нибудь, но с радиоактивностью никто работать не хочет. при том я что-то подумал, что NEM в наших условиях может с имидазольной группой гистидина и альфа-аминогруппами еще реагировать. так что вообще варимнтов много становится. но посижу посчитаю что к чему. |
|||||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
07.06.2007 // 14:37:42
А зачем вообще метить?! Вы же знаете где белок идет на 2D или bLue Native - делайте преп и красьте Coomassie, а если даже не краситься - режьте "пустое место" и в трипсин его... все шансов больше чем мучиться с непонятно работающей меткой |
|||||
|
shure Пользователь Ранг: 17 |
12.06.2007 // 13:52:57
спасибо метка уменьшает електрофоретическую подвижность - т.е. меченый белок на 2D геле будет левее и выше. серебром все красится отлично - сказал вырезать самый ближний спот левее и выше - посмотрим что получится. |
|||||
|
bf109xxl Пользователь Ранг: 1727 |
12.06.2007 // 15:53:21
Редактировано 1 раз(а) А если подвесить что-нибудь с нерадиоактивной элементорганикой? С йодом, например? Или металлом каким? И потом гель просканировать ЛА-ИСП-МС? Штука известная. Особливо будет красиво с нерадиоактивным препаратом, обогащенным по какому-нибудь изотопу - тогда не возникнет вопросов о происхождении элемента. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 10 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
