Форумы ANCHEM.RU: Осаждение белков из фосфатного буфера ацетонитрилом и ВЭЖХ-МС

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Осаждение белков из фосфатного буфера ацетонитрилом и ВЭЖХ-МС >>>

  Ответов в этой теме: 23
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

AlexGr
Пользователь
Ранг: 71

06.05.2009 // 10:01:05

Редактировано 2 раз(а)

chern_es пишет:
Данные последних экспериментов:

оказывается, дело не (только) в МС, а в плохой хроматографии.
При вводе 50 мкг/мл ранитидина в ацетонитриле (система ВЭЖХ-УФД-МС/МС) пик, регистрируемый УФД - достаточно узкий, а при 50 мкг/мл ранитидина в фосфатном буфере соотв. пик размазанный, хвостатый, некрасивый.
Колонка Chromolith RP-18e 100x4.6 мм. На другом приборе с другой колонкой (XBridge, С18, 5 мкм, 50х4.6мм) аналогичные проблемы.
i][/quot/]
Судя по Вашим результатам условия анализа крайне неоптимальные. Протокол анализа у Вас прописан для LC-MS? Фосфат конечно снижает интенсивность ионизации, но дело не в это, уйти от этого в процессе пробоподготовки (ТФЭ или ЖЖЭ) не сложно. Литературы по экстракции и анализу ranitidine много. Концентрации у Вас вообще огромные.
Посмотрите например: www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T57-4TC3509-4&_user=10&_coverDate=12%2F31%2F2008&_alid=913250181&_rdoc=18&_fmt=high&_orig=search&_cdi=4995&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=414&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=dfd9220391efa868852e27632c47b347
Удачи.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

chern_es
Пользователь
Ранг: 49

06.05.2009 // 11:05:27

Редактировано 1 раз(а)

trozen пишет:

2,7 мл/мин как-то многовато по-моему для аналитической колонки, хоть у монолитных и малое сопротивление, но эффективность может резко падать.. то, что времена удерживания почти не зависят от состава элюента говорит о том что колонка вообще ведет себя как пустая трубка..
я бы 0,7 мл/мин поставил, ну до 1 мл/мин по-любому
ТС

Мы наоборот боремся за малые времена выхода, поэтому и поставили монолитную колонку. 2.7 мл/мин для монолитных это мало, там и 5 мл/мин вполне можно давать. Методика отрабатывается таким образом, чтобы обеспечивать максимальную производительность.
Плюс видно же, что когда колем ацетонитрильный раствор - все ОК, пик узкий. Проблемы именно с раствором в фосф.буфере...

chern_es
Пользователь
Ранг: 49

06.05.2009 // 11:12:15

Редактировано 3 раз(а)

AlexGr пишет:
Судя по Вашим результатам условия анализа крайне неоптимальные. Протокол анализа у Вас прописан для LC-MS? Фосфат конечно снижает интенсивность ионизации, но дело не в это, уйти от этого в процессе пробоподготовки (ТФЭ или ЖЖЭ) не сложно. Литературы по экстракции и анализу ranitidine много. Концентрации у Вас вообще огромные.
Посмотрите например: ...

Концентрации у нас не такие уж и огромные, 50 мкг/мл я брала только для того, чтобы посмотреть форму пика на УФД, рабочие концентрации 500-5000 нг/мл.
Протокол анализа прописан для LC/MS/MS, взят отсюда: www.piercenet.com/files/2034as4.pdf
С пробоподготовкой по-разному пробовали, и ЖЖЭ и ТФЭ, пока что от фосфата избавиться не удалось. Хотя, может быть, дело в недостатке опыта.
Спасибо за ссылку на статью. К сожалению, у нас нет свободного доступа к литературным источникам. Но, по абстракту судя, фосфат в этой статье не фигурировал. А без фосфата, в ацетонитрильных экстрактах, у нас и у самих все замечательно определяется...

Елена

Medb
Пользователь
Ранг: 25

06.05.2009 // 14:09:12

мы сталкивались с похожими проблемами, когда начинали ВЭЖХ-МС. после использования фосфатного буфера пришлось потом долго отмывать источник (у нас ESI) от солей. кроме того, при работе с буферами нужно использовать такой специальный kit для промывки заплунжерного пространства. в конечном итоге, пришлось от фосфатного буфера отказаться совсем.

chern_es
Пользователь
Ранг: 49

06.05.2009 // 14:24:48

Редактировано 1 раз(а)

Medb пишет:
...такой специальный kit для промывки заплунжерного пространства.

Уважаемый Medb, скажите пожалуйста, что Вы называете заплунжерным пространством? это область в автосемплере хроматографа? разве фосфат может и там напортить? и, если можно, дайте пожалуйста ссылочку на кит...

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Динамический механический анализатор TA Instruments RSA-G2
Исследовательский прибор, способный совмещать с динамическими измерениями УФ облучение или диэлектрический анализ в различных режимах (сжатие, растяжение, изгиб по двум и трем точкам, пенетрация, сдвиг, растяжение или сжатие с погружением в жидкость) и с варьированием газовых сред, температур и режимов нагружения.

[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]

Medb
Пользователь
Ранг: 25

07.05.2009 // 11:26:07

устройство представляет собой колбочку с водой и несколько трубочек, подсоед. к насосу. просто обмывает плунжер насоса во избежание кристаллизации на нем всякой гадости. У нас прибор шимадзу 2010, кит мы заказывали в комплекте.

chern_es
Пользователь
Ранг: 49

07.05.2009 // 18:04:02

Medb пишет:
устройство представляет собой колбочку с водой и несколько трубочек, подсоед. к насосу. просто обмывает плунжер насоса во избежание кристаллизации на нем всякой гадости. У нас прибор шимадзу 2010, кит мы заказывали в комплекте.

А что, того, что плунжер постоянно омывается подвижной фазой - недостаточно? Интересно...

Всем участникам дискуссии спасибо.
Сняла монолитную колонку, поставила обычную XTerra 100x4.6mm, начала работать в градиенте при маленьком потоке - стало значительно лучше!

Medb
Пользователь
Ранг: 25

08.05.2009 // 16:34:00

если п.ф. - буфер - недостаточно. особенно фосфатный.

chern_es
Пользователь
Ранг: 49

08.05.2009 // 17:02:37

Medb пишет:
если п.ф. - буфер - недостаточно. особенно фосфатный.

В подвижной фазе фосфатного буфера нет. Буфер присутствует в анализируемых пробах.
Я так понимаю, что ранее я использовала слишком высокий поток, поскольку методы были заточены под минимизацию времени анализа, поэтому основной компонент практически не удерживался на колонке и элюировался совместно с фосфатным буфером. А если обеспечить условия, когда он выходит достаточно далеко от начала хроматограммы, то все будет ок.
Только вот анализ у меня был 1 минута, а теперь 5... непроизводительно, однако

MNataly
Пользователь
Ранг: 15

11.05.2009 // 15:25:47

Насколько я поняла, у вас колонка 100*4.6. Даже для монолита 5 мин анализа - это не много. Вы правильно сказали- оно у Вас не удерживалось и плохо ионизировалось. Надо или брать колонку меньше - есть такие спец для быстрого анализа (правда при больших давлениях. Еще может быть проблема с тем что Вы колете в ацетонитриле. надо будет или пробу уменьшать или воды добавлять. Вообще я работаю с похожей системой и буфер вроде не мешает.


Ответов в этой теме: 23 Страница: 1 2 3 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты