Форумы ANCHEM.RU: Нужно "вытащить" ион цинка из белка, какой хелатор посоветуете?

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Нужно "вытащить" ион цинка из белка, какой хелатор посоветуете? >>>

  Ответов в этой теме: 18
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Леонид
VIP Member
Ранг: 5266

07.11.2008 // 18:44:09

Волгин пишет:
Дурная мысль в голову пришла. Если не в тему, не бейте больно! В "БиоХимМаке СТ" делают сорбент с иммобилизованной иминодиуксусной кислотой. Может пропустить через него (или колонку с ним) раствор Вашего белка в подходящем элюенте?

Кстати - да. Как-то вылетело из головы...
Отлично проходит, обычно.

С белка - точно снимет. Ну, 3 порядка разницы рК - будет, наверное, достаточно.
Количественно, или нет, проверять надо.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

07.11.2008 // 19:37:59

Леонид пишет:
С белка - точно снимет. Ну, 3 порядка разницы рК - будет, наверное, достаточно.

Иногда - недостаточно. Например, из-за стерических трудностей - ну малодоступен металл из-за особенностей трехмерной структуры белка. Если ЭДТА почти не вымыл цинк оттуда, то есть сомнения, что это удастся имидоуксусу. Но попробовать есть резон, однозначно.

peroxid
Пользователь
Ранг: 4

07.11.2008 // 20:41:46

Редактировано 1 раз(а)

Спасибо откликнувшимся!

Итак, по порядку, фермент - сериновая олигопептидаза, новая и пока неизученная. Предположение, что цинк может играть какую-то роль в функционировании фермента было сделано на основе нескольких косвенных данных: ингибирование хелаторами (значит двухвалентные металлы как-то задействованы), ингибирование самим цинком (по данным литературы это характерно для цинковых ферментов), плюс консенсусные последовательности в аминокислотной цепи. Чтобы строго доказать, и нужны все эти танцы с бубнами. Цинк из-за своих свойств- все же весьма удобный металл для белков, так что может и в нашем случае он играет какую-то роль. Причем не обязательно каталитическую, возможно несколько функций, в том числе и структурная и кокаталитическая.

bf109xxl - Да, так делают, вытаскивают. Причем довольно давно, например вот в этой статье можете почитать: www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1218219.
А западнее Москвы это где, никак Калининград?

Теперь по поводу ЭДТА - ингибирует, (при концентрации в растворе 5 10^-3 M остаточная активность 60%), однако долго диализовать против буфера с ЭДТА не получается (диализовали как-то раз 2 суток) - белок дохнет быстрее (хотя, может просто белка больше взять надо было?). Просто обычно такая концентрация ЭДТА для металлоферментов достаточная для ингибирования.

hongma, возможно Вы и правы, для выковыривания цинка может стоить попробовать более высоките концентрации ЭДТА, только меня смущает, не денатурирует ли белок при высоких концентрация хелатора вседствие причин не обусловленных изъятием металла?

Spectrometrist Белок, когда ставили опыт был процентов на 60 чистый (но других протеаз в растворе не было). Получить в больших количествах из дикого штамма было проблематично, сейчас после переклонирования можно получить и больше. субстрат специфичен - это проверено, протеазка вообще оч. специфичная.

Ян, а Ваша идея мне понравилась! Где-то в лаборатории завалялась фенилсефароза, может на нее удастся посадить фермент.

Леонид
VIP Member
Ранг: 5266

07.11.2008 // 22:00:00

bf109xxl пишет:

Леонид пишет:
С белка - точно снимет. Ну, 3 порядка разницы рК - будет, наверное, достаточно.
Иногда - недостаточно. Например, из-за стерических трудностей - ну малодоступен металл из-за особенностей трехмерной структуры белка. Если ЭДТА почти не вымыл цинк оттуда, то есть сомнения, что это удастся имидоуксусу. Но попробовать есть резон, однозначно.

Кто бы спорил... Вариантов таких - масса.
Ну тут, в форуме, мы все достаточно часто совершаем "аборт по телефону" . Так что - извиняйте, ежели что не так...

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

07.11.2008 // 23:54:38

peroxid пишет:
А западнее Москвы это где, никак Калининград?

Да нет, еще километров эдак с 1000 западнее. Если есть желание - обращайтесь, посотрудничаем, тема навскидку очень и очень интересная и публикабельная, а у нас есть "джентельменский набор" - ICP-MS (LA-&HPLC-), AAS, авторадиография, MALDI (перечислять биометоды смысла, думаю, нет). В любом случае было бы интересно ознакомиться с результатами данного Вашего исследования, опубликованными в каком-нибудь журнале.

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Центр коллективного пользования "Состав вещества" ИВТЭ УрО РАН
Центр выполняет по договорам аналитические исследования по элементному и вещественному анализу методами плазменно-эмиссионной спектроскопии, рентгенодифрактометрии, сканирующей электронной микроскопии, рентгеноспектральному и Рамановскому микроанализу на современном оборудовании

peroxid
Пользователь
Ранг: 4

09.11.2008 // 22:48:06

Редактировано 1 раз(а)

у нас есть "джентельменский набор" - ICP-MS (LA-&HPLC-), AAS, авторадиография, MALDI

Хороший у Вас набор, bf109xxl, пользительный

Результаты работы пока еще пути в журнал, где-то через полгода выйдут (правда чисто металлической части там будет мало, тут надо еще работать). По поводу сотрудничества, мне было бы интересно, надо потерзать шефа, как он на это посмотрит)

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

10.11.2008 // 11:03:12

peroxid пишет:
По поводу сотрудничества, мне было бы интересно, надо потерзать шефа, как он на это посмотрит)

Если охарактеризовать одновременно HPLC-ICP-MS плюс - если цинк не вымоется - PAGE (пробовать и SDS, и натив)-LA-ICP-MS плюс MALDI - возможно, будет уже достаточно для короткой публикации в приличном журнале. Кроме того, там может быть не только цинк - специфичность к металлу тоже интересно было бы глянуть.

Raf
Пользователь
Ранг: 6

21.04.2009 // 0:21:54

Прошу прощения за долгий ответ, все никак не мог пароль вспомнить (и на какую электропочту регистрировал тоже забыл). Пришлось еще раз регистрироваться.

С белком все разрешилось, спасибо, bf109xxl за предложение. Цинка там не оказалось, а орто-фенантролином ингибировался не из-за хелатирующего действия, а в результате связывания его с гидрофобным участком фермента (контрольный опыт с мета-фенантролином открыл нам глаза


Ответов в этой теме: 18 Страница: 1 2 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты