1.2 Закономерности хроматографического разделения в колонке

Итак, рассмотрим хроматографическую (сорбционную) систему, состоящую из колонки, заполненной сорбентом, и протекающего через него элюента. Если на вход колонки поместить некоторое ограниченное количество пробы - смеси из двух различных веществ (сорбатов) X и Y, то существует три варианта поведения этих веществ в колонке:

• молекулы веществ не взаимодействуют с сорбентом и двигаются по колонке с той же скоростью, что и элюент;
• вещества, с умеренной интенсивностью взаимодействуя с сорбентом, продвигаются по колонке с элюентом, но значительно медленнее, чем его основной поток и, в конечном итоге, также выходят из колонки;
• вещества за счет чрезмерно сильного взаимодействия полностью поглощаются сорбентом уже в начале колонки и не могут быть полностью смыты элюентом данного состава, сколь бы много его через колонку не прошло.

Первый и третий вариант с точки зрения хроматографии неприемлемы и проявляются, когда для разделяемых веществ неправильно подобрана хроматографическая система (сочетание типа сорбента и состава элюента). А вот второй вариант развития событий является самым оптимальным, поскольку предполагает умеренное взаимодействие разделяемых веществ с сорбентом (сорбцию), не препятствующее также и вымыванию этих веществ с сорбента в объем элюента (десорбцию).

Сила такого взаимодействия молекул компонентов смеси с сорбентом для каждого из соединений X и Y будет различной, а значит, - и средняя скорость продвижения молекул разного вида также будет отличаться. В конечном итоге, то вещество (например, Y), которое в силу особенностей своего химического строения будет взаимодействовать с сорбентом сильнее – выйдет из колонки позже и таким образом отделится от вещества X, вышедшего с потоком элюента значительно раньше. На этом и основан принцип хроматографического разделения. В этом случае говорят, что удерживание вещества X в данной хроматографической системе меньше, чем вещества Y.

Безусловно, рассмотрен идеализированный вариант. На практике же разделяемая смесь вводится в колонку в виде узкой зоны и ее объемом по сравнению с объемом колонки можно пренебречь. По мере перемещения молекул разделяемых веществ с потоком элюента зона постепенно расширяется и разделяется на две,  при этом концентрация разделяемых веществ в каждой из зон уменьшается. Главная причина данного процесса в том, что скорость перемещения по колонке отдельных молекул, отличается от средней скорости, характерной для данного соединения. Это явление называют размыванием хроматографической зоны, которое приводит на выходе колонки к постепенному нарастанию концентрации сорбата в элюенте до некоторого максимального значения, которое значительно меньше концентрации этого же компонента на входе в колонку, и таким же постепенным спадом концентрации до нулевого уровня, образуя концентрационный профиль в реальном времени. В идеальном случае концентрационные профили веществ на выходе из колонки имеют колоколообразный вид, описываемый кривой статистического распределения Гаусса. Размывание в хроматографии – процесс крайне нежелательный и его стараются свести к минимуму, используя различные технические и методические приемы как на стадии изготовления хроматографического оборудования и материалов, так и на стадии непосредственно хроматографического разделения.

Если представить в графическом виде зависимость величины концентрации разделяемых веществ на выходе из колонки от времени, прошедшего с начала разделения, то мы получим хроматограмму, а концентрационные профили сорбатов на ней называют хроматографическими пиками (рис. 1.1). Если разделение в колонке состоялось, то каждому пику на хроматограмме соответствует одно индивидуальное вещество, первоначально присутствовавшее в смеси. Отсутствию на выходе из колонки разделяемых веществ на хроматограмме соответствует прямая линия, которую называют нулевой или базовой линией. Не трудно догадаться, что площадь на хроматограмме, ограниченная пиком и базовой линией, является количественной мерой содержания данного компонента в смеси.

Рис. 1.1 Обработка хроматограммы для расчета основных параметров удерживания и эффективности.

Каждому i-тому пику на хроматограмме соответствует время, прошедшее с момента начала разделения, которое фиксируется по вершине пика, то есть по достижению максимальной концентрации компонента на выходе из колонки. Это время называют временем удерживания и оно, наряду с шириной и формой пика, является основной характеристикой, на основании которой проводят идентификацию вещества на хроматограмме и оценивают качество разделения. Произведение времени выхода на объемную скорость движения элюента в колонке (u) дает еще одну важную характеристику – удерживаемый объем. Это тот объем элюента, который необходим, чтобы элюировать (вымыть) данный компонент из колонки.

          V_i = t_i · u              (1).

 Для получения количественных характеристик разделения, хроматограмму обрабатывают, т.е. проводят ряд измерений и расчетов. Для большинства таких расчетов необходима еще одна характеристика хроматографической системы – мертвый объем  колонки – V₀. Это объем элюента, необходимый для заполнения пор сорбента и пространства между его частицами в колонке. Учитывая, что эта величина равна удерживаемому объему (соответствует времени удерживания – t₀) несорбирующегося вещества, на практике ее находят, производя добавку в разделяемую смесь такого вещества (маркера) и его удерживаемый объем принимают за V₀. В некоторых случаях в этом нет необходимости, поскольку для многих хроматографических систем характерны ложные пики в начале хроматограммы (артефакты), соответствующие вводу пробы в колонку и связанные с нарушением при этом сорбционного равновесия между сорбентом и элюентом. Тогда этот артефакт можно использовать для расчета величин t₀ и соответственно, по формуле (1) - V₀. Но,  тем не менее, всегда не лишним будет проверить, действительно ли соответствует время проявления данного артефакта мертвому времени.

Для эксклюзионной хроматографии, которая стоит несколько обособлено от классической ЖХ и основана на совершенно других физических принципах, важен другой показатель – исключенный объем колонки V_е. Он равен объему элюента, занимающему в колонке пространство снаружи частиц сорбента. В этом режиме, где разделение происходит исключительно за счет разницы размеров молекул сорбатов, вся хроматограмма выходит как раз в ограниченном объеме между V_е и V₀. В классической  ЖХ (адсорбционной, распределительной  и пр.) этот параметр неинформативен, а потому обычно не используется при расчетах.

Основной характеристикой удерживания, наиболее объективно отражающей степень взаимодействия данного вещества с сорбентом, является коэффициент емкости или фактор удерживания k´, который, в отличие от времени удерживания и удерживаемого объема, зависит только от параметров хроматографической системы (типа сорбента, состава элюента, температуры и т.п.) и не зависит от геометрических размеров колонки и скорости протока элюента. Его вычисляют по формуле:

k´_i = (V_i - V₀) / V₀        (2)

Очевидно, что при постоянной объемной скорости элюента, выражение (2) можно преобразовать следующим образом:

k´_i = (t_i - t₀) / t₀          (3)

Выражение в числителе (3) широко используется в хроматографических расчетах, называется исправленным (приведенным) временем удерживания и обозначается t´_i.

Физический смысл k´ достаточно прост – это отношение концентрации данного вещества (сорбата) на поверхности сорбента к его концентрации в элюенте при установившемся динамическом сорбционном равновесии.

На практике, подбором параметров хроматографической системы стараются добиться оптимального интервала значений k´, которое находится в пределах от 2 до 10. Именно в этом интервале достигается наиболее качественное разделение компонентов при приемлемом времени хроматографического эксперимента. Но для некоторых разделений этот параметр может значительно отличаться от рекомендуемых значений. Единственное правило, которого стоит придерживаться – не использовать хроматографическую систему для практических приложений, если при этих условиях k´ хотя бы одного из целевых компонентов пробы имеет значение менее 0,3 – 0,5. В этом случае, мало того, что в этой области хроматограммы разделительные свойства хроматографической системы будут явно не реализованы, но и высока вероятность наложения возможных артефактов на пики сорбатов.

При разделении двух и более компонентов смеси становится немаловажной другая характеристика применяемой хроматографической системы – селективность, количественную характеристику которой - α, называют коэффициентом селективности или фактором разделения. Она может быть вычислена по хроматограмме (рис. 1.1) для любой пары разделяемых веществ из соотношения:

α = t´₂ / t´₁ = k´₂ / k´₁        (4)

где: 
t´₂ – исправленное время удерживания более поздно выходящего компонента,
t´₁ - исправленное время удерживания более рано выходящего компонента; аналогично и для факторов удерживания.

Из соотношения (4) видно, что если на данной хроматографической системе коэффициент селективности близок к единице и при достаточно большом значении k´, то даже если увеличить длину колонки, эти два компонента разделить наверняка не удастся и лучше использовать хроматографическую систему с иной селективностью.

Коэффициент селективности растет с увеличением k´, но эта зависимость асимптотически нелинейна, и прирост a ощутим при увеличении k´ примерно до 3 - 4. Таким образом, если при достижении k´ = 4, необходимой селективности разделения добиться не удалось, то дальнейшее увеличение удерживания компонентов наверняка не приведет к улучшению разделения, а лишь увеличит время анализа.

Кроме параметров удерживания и селективности, по хроматограмме можно количественно оценить степень размывания хроматографических зон в данной хроматографической системе. Размывание приводит к уширению пика, которое проявляется тем больше, чем больше k´ данного компонента. Количественно уширение хроматографического пика характеризуется значением, называемой эффективностью и выражается числом теоретических тарелок N, а вычисляется по формуле:

N = 5,545 (t_i / Δt_х)²        (5)

Где:
t_i – время удерживания данного компонента,
Δt_х – время выхода пика от половины его высоты на подъеме до половины высоты на спаде (полуширина пика).

Иногда вместо времени удерживания в формулу (5) подставляют исправленное время удерживания t´_i и получают значение приведенной эффективности N´, более применимое в газовой хроматографии.

Если найти отношение длины колонки к ее эффективности (L / N), то получим другой параметр, обратный эффективности – высоту, эквивалентную теоретической тарелке H (ВЭТТ). Обе эти величины имеют вполне конкретный физический смысл, который можно определить - для N, как число элементарных актов сорбции-десорбции, произошедшие с веществом при его движении по колонке, а для H – как высоту слоя сорбента в колонке, на котором происходит единичный акт сорбции-десорбции. Эти величины имеют больше вероятностно-статистический характер и для умозрительного представления процессов, происходящих на поверхности сорбента, их лучше не использовать. Отсюда следует, что эффективность прямо пропорциональна длине колонки.

В первую очередь эффективность зависит от основных свойств примененного сорбента и качества упаковки им колонки, а потому этот показатель обязательно приводится в паспорте на каждую поставляемую хроматографическую колонку и считается неотъемлемой ее характеристикой. Тем не менее, эффективность также существенно зависит от условий эксплуатации и свойств всей хроматографической системы в целом. В частности, такие параметры, как температура, скорость потока элюента, его состав и химическое строение разделяемых веществ могут сильно повлиять на реально достижимую эффективность, которая, на практике - в большинстве случаев, получается значительно меньше паспортной.

В первую очередь, уширение пиков вызывает сам принцип побуждения протока элюента через слой сорбента. В подавляющем большинстве случаев – это перепад давления на входе и выходе колонки. Однако, при этом неизбежно проявляется так называемый стеночный эффект, заключающийся в том, что скорость потока элюента у стенки колонки гораздо ниже, чем в ее центре. Поэтому профиль скоростей элюента по сечению колонки имеет форму параболы. Для исключения этого эффекта, относительно недавно (начало 90-х годов прошлого века) был предложен метод электрохроматографии, где прохождение элюента через слой сорбента обеспечивается электроосмотическим потоком, создаваемым наложением электрического поля на вход и выход колонки, аналогично тому, как это происходит при капиллярном электрофорезе. Это позволяет создать профиль скорости элюента по сечению колонки, близкий к плоскому и достигнуть эффективности разделения в несколько сот тысяч и даже в миллионы теоретических тарелок на капиллярных или ультратонких колонках.

Тем не менее, этот перспективный вид хроматографии пока еще не очень распространен, поэтому рассмотрим другие основные причины, приводящие к размыванию хроматографической зоны, уширению пиков и, как следствие - снижению эффективности при хроматографическом разделении на обычных колонках, где поток элюента обеспечивают насосы различной конструкции.

Во-первых, это неоднородность потока подвижной фазы. Сорбент в колонке образует систему каналов, через которые и протекает элюент. Чем мельче и ближе друг другу по размерам частицы сорбента, тем более одинаковые пути проходят в колонке молекулы элюента и соответственно - меньше разница во времени для проходящих через колонку молекул одного компонента.

Во-вторых, наличие продольной и поперечной молекулярной диффузии разделяемых веществ в подвижной и неподвижной фазах, ощутимо влияющее на скорость единичного акта сорбции, особенно при наличии тупиковых пор в сорбенте. Чем больше скорость потока, тем меньше размывание из-за этой причины.

В-третьих, ограниченная скорость массообмена – на прохождение акта сорбции-десорбции нужно определенное время. Чем больше скорость потока, тем больше размывание из-за этой причины. Понижение температуры и увеличение молекулярной массы сорбатов также тормозит массообмен между сорбентом и элюентом, а потому способствует размыванию.

Таким образом, только первая причина размывания хроматографических зон может быть отнесена к качеству изготовления колонки.

Две других зависят больше от условий эксплуатации колонки. Причем влияют на эффективность разделения противоположным образом.

Кроме приведенных причин, размыванию хроматографических зон могут способствовать особенности конструкции колонки, соединительных гидравлических узлов, линий и кюветы детектора. Эти факторы обуславливают, так называемое - внеколоночное размывание хроматографических зон и также снижают общую эффективность разделения.

Все перечисленные причины уширения пиков можно описать соответствующими математическими зависимостями, а их суммарное действие выразить итоговой формулой, известной как уравнение Ван-Деемтера (6), где каждое из трех слагаемых по порядку соответствует ранее описанным факторам.

Его графическое выражение, описывающее зависимость высоты эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), от линейной скорости потока элюента, представляет собой кривую с ярко выраженным минимумом (рис. 1.2). Скорость потока элюента, соответствующая этому минимуму, и является оптимальной для достижения максимальной эффективности колонки при прочих равных условиях.

H = A + B/u + Cu ,        (6)

Где: 
А – степень неоднородности структуры упакованного в колонку сорбента,
В – коэффициент, учитывающий вклад диффузии данного сорбата в подвижной и неподвижной фазах,
С – константа, определяющая массообмен сорбата между сорбентом и элюентом.

Рис. 1.2. Вид кривой Ван-Деемтера.

Особенно стоит обратить внимание на несимметричность ветвей кривой, а это значит, что небольшое превышение оптимальной скорости потока ведет к гораздо меньшей потере эффективности, нежели работа колонки со скоростью потока на столько же ниже оптимальной. И действительно, на практике многие хроматографисты обеспечивают через колонку несколько повышенную скорость протока элюента, что дает заметный выигрыш по времени разделения при незначительной потере эффективности.
Сочетание эффективности и селективности полностью определяют разделительные свойства хроматографической системы. На рис. 1.3 наглядно показано, как эти два параметра влияют на вид хроматограммы.
Исходя из величин селективности, коэффициента емкости и эффективности можно рассчитать фактор разрешения R_S двух соседних пиков на хроматограмме. Этот же параметр в хроматографической литературе иногда называют критерием разделения (не путать с фактором разделения α !), однако, обозначают так же и вкладывают в него абсолютно такой же смысл.

Рис. 1.3. Влияние эффективности и селективности на степень разделения веществ.

Из выражения для R_S следует очень важный вывод. Повышение эффективности колонки в два раза, увеличением, например, ее длины, приведет при прочих равных условиях к улучшению разделения компонентов лишь примерно в 1,4 раза (√2). По этой причине в хроматографии малоэффективны экстенсивные меры по улучшению разрешения пиков.

 Из рис. 1.4 видно, что практически полное разделение пиков достигается лишь при R_S = 1,5. Но для большинства практических приложений, достаточно R_S = 1,2 и даже несколько меньше.

Как уже говорилось, в идеале форма пика должна иметь вид кривой распределения Гаусса. На практике это далеко не всегда так. Чаще пик имеет более или менее значительные отклонения от классической формы.

Это явление называют асимметрией пика и при хроматографическом разделении оно крайне нежелательно. Его можно представить в количественном виде путем несложных измерений на хроматограмме. Для этого (рис. 1.5) параллельно нулевой линии хроматограммы на высоте, равной 0,1 высоты пика, проводят вспомогательную линию, а из вершины пика опускают на нее перпендикуляр. Он отсекает два отрезка – a и b. Отношение длины отрезка b к длине отрезка a и дает коэффициент асимметрии данного пика s_a.

Рис. 1.5. Расчет коэффициента асимметрии пика.

Причиной искажения формы пика является отклонение от линейности изотермы сорбции вещества в данной хроматографической системе (рис. 1.6). В свою очередь, причины отклонения от линейности изотермы сорбции могут быть самыми различными и зависят от специфики механизма сорбции для каждого из многочисленных режимов ЖХ.

Чаще всего – это подключение к основному механизму сорбции дополнительных паразитных взаимодействий разделяемых веществ с сорбентом и наличие в разделяемой смеси разных форм одного и того же сорбата, которые способны превращаться друг в друга в соответствии с константой равновесия между этими формами.

На практике это наиболее часто приводит к затянутому заднему фронту пика, который на хроматографическом сленге называют «хвостом».

Гораздо реже происходит уширение переднего фронта (на сленге - «борода», «живот», «нос»), одной из причин которого может быть и перегрузка сорбента разделяемой пробой. В этом случае достаточно снизить количество дозируемой в колонку смеси веществ, чтобы форма пиков на хроматограмме выровнялась.

Рис. 1.6. Изменение формы пика в зависимости от вида изотермы сорбции.
С_S - концентрация вещества в твердой фазе
С_М - концентрация вещества в жидкой фазе

В современной ВЭЖХ максимально допустимая загрузка колонки разделяемыми веществами составляет примерно 10 мкг на грамм сорбента. Более значительные количества пробы, вводимой в хроматографическую колонку, приводят к существенной потере эффективности разделения и допустимы только в препаративных приложениях ЖХ.

Считается, что искажения формы пика не сильно влияют на качество разделения при коэффициенте асимметрии, не превышающем 2 - 2,5. Если асимметрия больше, то это может значительно ухудшить параметры хроматографического разделения и, даже если разделение осталось на достаточном уровне, желательно предпринять какие либо меры, для снижения асимметрии до приемлемого значения. Это одинаково значимо как для препаративной, так и для аналитической хроматографии.

В аналитической хроматографии основная проблема в том, что при значительной «хвостатости» пика, его площадь перестает линейно зависеть от концентрации хроматографируемого вещества при ее последовательном уменьшении, а время удерживания увеличивается по мере уменьшения концентрации таким образом, что затянутый задний фронт становится огибающей кривой месторасположения вершин хроматографических пиков (рис. 1.7). Это обстоятельство существенно затрудняет идентификацию пиков компонентов на хроматограмме, а, в конечном итоге, при достаточно малых концентрациях, в такой хроматографической системе вещество вообще может исчезнуть с хроматограммы, то есть - просто необратимо сорбироваться в колонке. Бывают и счастливые исключения, но не часто.

В препаративной же хроматографии подобное явление может существенно воспрепятствовать выделению чистого вещества из пробы.

Рис. 1.7. Изменение времени удерживания компонента на хроматограмме
при уменьшении его концентрации и большой асимметрии пика.

Первоочередной мерой по устранению асимметрии пика (пиков) может быть кардинальное изменение свойств хроматографической системы, которое достигается коррекцией состава элюента и/или использованием другого типа сорбента. В зависимости от используемого режима и механизма разделения, весьма эффективным может оказаться динамическое модифицирование хроматографической системы, которое подробней будет рассмотрено далее.