1.4 Основные типы хроматографических систем в ВЭЖХ

По типу используемых сорбентов, механизмам сорбции, протекающим на границе раздела фаз и составу элюента, жидкостную хроматографию можно разделить на несколько вариантов ее реализации: 

1. Нормально-фазовая,
2. Обращенно-фазовая,
3. Ионо-обменная,
4. Эксклюзионная (ситовая, гель-проникающая).

Данный перечень включает только наиболее распространенные и часто встречающиеся варианты ЖХ, хотя наибольшее количество аналитических задач в хроматографии (до 98 %) решается с использованием первых трех вариантов.

Для решения специальных задач разделения существуют и специфические виды ЖХ, например, лигандообменная и аффинная, которые трудно отнести к какому либо из перечисленных. Однако, их использование весьма ограничено и подробное рассмотрение в рамках данного раздела, видимо - нецелесообразно.

Кроме приведенной классификации, существует разделение вариантов ЖХ на основе реализуемых в хроматографической системе механизмов сорбции. Так, например, различают хроматографию: адсорбционную, распределительную, ион-парную, гидрофобную, гидрофильную и т.д. Тем не менее, учитывая, что среди хроматографистов до сих пор нет единого мнения о механизмах протекания взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом даже в относительно простых сорбционных системах, такая классификация достаточно условна. Более того, следует признать, что сорбционные взаимодействия крайне редко протекают по какому-то одному механизму. Чаще проявляется одновременно несколько механизмов сорбции. Следует также учесть, что в одних и тех же условиях один из компонентов пробы может удерживаться на сорбенте по одному механизму, а другой – по совершенно иному.

Нормально-фазовая (НФ) хроматография – исторически первый вариант ЖХ. Основной его отличительной особенностью является более высокая полярность поверхности сорбента по сравнению с элюентом.

В качестве сорбента используется либо силикагель, либо сорбенты на его основе с полярными группами (амин-, нитрил-, диол- и т.п.), химически пришитыми на поверхность. Гораздо реже используют другие неорганические вещества с полярной поверхностью: оксид алюминия, оксид циркония, силикат магния и т.п.

Элюентом служат смеси органических растворителей. Элюотропный ряд с увеличением силы элюента строится от наименее полярных к более полярным веществам:

Алканы – пентан, гексан, гептан, изооктан;
ароматические углеводороды - бензол, толуол, ксилол;
галогеналканы – хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан;
эфиры – диэтиловый, диизопропиловый, тетрагидрофуран, диоксан, этилацетат, бутилацетат;
кетоны – ацетон, метилэтилкетон, циклопентанон;
нитрилы и амиды – ацетонитрил, диметилформамид
спирты – изопропанол, этанол, метанол;
вода, низкомолекулярные карбоновые кислоты.

Двухкомпонентные элюенты без модификаторов, содержащие значительные количества воды, в нормально-фазовой хроматографии практически не используются. Однако, при введении в водосодержащий элюент специальных модифицирующих добавок, например – солей, на силикагеле, например, можно реализовать интересные режимы разделения, и такие хроматографические системы находят в настоящее время все большее применение.

Обращенно-фазовая (ОФ) хроматография – вариант, когда сорбент является неполярным, а элюент – полярным. То есть, по отношению к нормально-фазному режиму – все наоборот. Это и дало основание так назвать этот вид ЖХ, который является самым распространенным из всех существующих.

В качестве сорбента для ОФХ чаще всего используют силикагель, с химически пришитыми к его поверхность алкильными группами разной длины (октадецил, гексадецил, октил, бутил, метил) и другими неполярными молекулами (фенил). В последнее время все чаще применяются сорбенты на основе двуокиси циркония, углерода и органических полимеров, например, сверхсшитого полистирола, сополимера стирола с дивинилбензолом и т.п. В ОФ режиме могут использоваться также и сорбенты, предназначенные для НФ-хроматографии (амино- и нитрилсиликагель), в этом случае их свойства в плане удерживания (коэффициента емкости) близки к этил- или пропилсиликагелю, но селективность разделения может существенно отличаться.

Элюентом в этом режиме являются смеси воды (или водных растворов солей) с водосовместимыми органическими растворителями. Сила элюента увеличивается от самого полярного растворителя (вода), к самому неполярному.

Вода;
Метанол;
Ацетонитрил;
Этанол;
Тетрагидрофуран;
Изопропанол, пропанол;
Диоксан, этилацетат, эфир.

Элюенты без воды используются крайне редко, но бывают случаи применения в обращенно-фазных хроматографических системах (особенно - на полимерных сорбентах) смесей метанол-диоксан, или даже - изопропанол-хлороформ, что связано с необходимостью существенно изменить селективность разделения или добиться уменьшения удерживания таких малополярных веществ, как, например, углеводороды или жиры (триглицериды жирных кислот).

Вода без органических растворителей в качестве элюента для ОФ режима - обычно также не применяется. Лишь некоторые из обращенно-фазовых сорбентов, принципиально могут работать без ущерба для себя с таким элюентом. Большинство же ОФ сорбентов в воде, мало того, что плохо смачиваются, но и подвержены коллапсу - разрушению структуры поверхности, когда алкильные цепочки схлопываются и поверхность сорбента теряет свои первоначальные сорбционные свойства. Исходя из этого, нежелательна работа на таких сорбентах с элюентом на основе воды, содержащем менее 5 - 10% органического растворителя.

Ионо-обменная хроматография – предназначена, в основном, для разделения неорганических ионов и ионогенных органических веществ.
В качестве сорбентов используются ионообменные смолы или сорбенты на основе силикагеля с химически модифицированной поверхностью, на которой сформированы функциональные группы, способные к ионному обмену.

Элюентом в этом варианте хроматографии выступают водные растворы солей или буферных систем на их основе. Увеличение элюирующей силы обеспечивается изменением рН, увеличением ионной силы растворов и добавкой органических растворителей. Следует отметить, что большинство сорбентов на основе силикагеля нестойки в щелочной среде, а потому их использование возможно лишь в интервале рН от 2 до 8 - 10 (иногда – меньше). И, если условия хроматографии изначально требуют использования более высоких рН элюента, лучше сразу выбрать сорбент на основе полимера или другого гидролитически стойкого материала.

Эксклюзионная хроматография – пожалуй, наиболее сильно отличается от других видов ЖХ как по принципу разделения, так и по методическим особенностям. Предназначена она преимущественно для разделения крупных молекул и частиц, в частности – полимеров, в соответствии с их размером. При этом сорбции веществ как таковой не происходит, а разделение обеспечивается за счет способности более мелких молекул в процессе продвижения с потоком элюента по колонке заходить в мелкие поры сорбента, увеличивая тем самым длину своего пути в колонке. Крупные молекулы из-за своих размеров попасть в мелкие поры не могут и вынуждены совершать свой путь по колонке с «заходом» в гораздо более широкие поры, а то и вообще без проникновения в поры сорбента. Благодаря этому длина пути в колонке крупных молекул (частиц) оказывается наименьшей, и они выходят раньше более мелких, а те, в свою очередь, выходят раньше еще более мелких, разделяясь при этом исключительно по размерам.

Если есть возможность и нет необходимости разделять вещества именно по размерам их молекул, то эксклюзионной хроматографии стоит предпочесть любой другой вид ЖХ, поскольку эксклюзионная хроматография наиболее бедна в плане наличия степеней свободы для воздействия на хроматографический процесс.

В качестве сорбентов используются различные широкопористые полимерные и минеральные субстраты, в частности - акриловые и полиуглеводные полимеры, а также особые силикагели – широкопористые стекла. Ассортимент сорбентов для эксклюзионной хроматографии очень широк, и выбор конкретного сорбента полностью определяется химической структурой и диапазоном молекулярных масс, предполагаемых к разделению компонентов пробы.

Элюентом может служить любой растворитель, который хорошо растворял бы образец и обеспечивал на данном сорбенте отсутствие сорбции («отрицательную» сорбцию) компонентов пробы. Это как раз тот вариант, когда элюент может быть однокомпонентным. На силикагелевых сорбентах часто используют тетрагидрофуран, ацетон, дихлорэтан. На полимерных – спирты, воду и их смеси.

В общем случае, для эксклюзионной хроматографии элюирующая сила используемого растворителя, как параметр - теряет свой первоначальный смысл. Существенно изменить делящие свойства хроматографической системы в этом режиме может только замена сорбента.