Форумы ANCHEM.RU: Кто работал с каротиноидами?

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Кто работал с каротиноидами? >>>

  Ответов в этой теме: 11
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Автор

Тема: Кто работал с каротиноидами?

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

27.07.2011 // 10:50:38

Есть ли тут те, кто имел опыт работы с каротиноидами? в частности, с этерифицированными жирными кислотами?
Вопрос, собственно в следующем, можно ли энзиматический гидролиз холестерол эстеразой заменить на омыление водно-спиртовым 4% раствором КОН в темноте на холоду? какая для этого годится температура и длительность реакции?

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

27.07.2011 // 13:16:54

Редактировано 1 раз(а)

Многое зависит от конкретной ситуации, требований и т.д., в большинстве случаев данная замена не равноценна. В общем, для данного типа задач, в основном применяют ферментативный гидролиз, что позволяет значительно "смягчить" условия.

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

27.07.2011 // 14:03:16

virtu пишет:
Многое зависит от конкретной ситуации, требований и т.д., в большинстве случаев данная замена не равноценна. В общем, для данного типа задач, в основном применяют ферментативный гидролиз, что позволяет значительно "смягчить" условия.

Суть такая в кратце: получили в тонком слое три окрашенных фракции, сняли спектры поглощения в видимой области, затем пустили на HPLC - в каждой фракции оказалось от 2 до 5 главных компонентов каротиноидной природы. Затем фракции омылили, отделили неомыляемые и их снова в HPLC - времена удерживания сдвинулись на несколько минут, но в целом хроматограммы оказались по набору и формам пиков идентичны.
Омыляемые липиды прометилировали и пустили в GC-MS и обнаружили жирные кислоты. Т.е. все работает, кроме одной фракции, которая не выдержала часового кипячения в водно-спиртовой щелочи - HPLC неомыляемых компонентов ничего не обнаружила, точнее, нашлись лишь рожки да ножки.
Сегодня порылся в архивах, нашел методики, но они все заточены под HPLC смеси, т.е. без фракционирования в тонком слое и без анализа жирных кислот методом GC-MC. То есть, колют в HPLC сперва нативные пигменты, затем гидролизуют с ферментом и колют неомыляемые, а затем вычисляюют состав смеси.
Вот в кратце и все описание задачи. С ферментами возиться уж очень не хочется (

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

27.07.2011 // 18:08:43

Редактировано 1 раз(а)

Chamomillablue пишет:

Суть такая в кратце: получили в тонком слое три окрашенных фракции, сняли спектры поглощения в видимой области, затем пустили на HPLC - в каждой фракции оказалось от 2 до 5 главных компонентов каротиноидной природы. Затем фракции омылили, отделили неомыляемые и их снова в HPLC - времена удерживания сдвинулись на несколько минут, но в целом хроматограммы оказались по набору и формам пиков идентичны.

Значит эфиров каротиноидов в 2 фракциях нет, если я правильно понял.

Т.е. все работает, кроме одной фракции, которая не выдержала часового кипячения в водно-спиртовой щелочи - HPLC неомыляемых компонентов ничего не обнаружила, точнее, нашлись лишь рожки да ножки.

Не понятно. Значит эта фракция может содержать эфиры ксантофиллов.

Сегодня порылся в архивах, нашел методики, но они все заточены под HPLC смеси, т.е. без фракционирования в тонком слое и без анализа жирных кислот методом GC-MC. То есть, колют в HPLC сперва нативные пигменты, затем гидролизуют с ферментом и колют неомыляемые, а затем вычисляюют состав смеси.
Вот в кратце и все описание задачи. С ферментами возиться уж очень не хочется (

Невозможно прокомментировать, т.к. Ваша задача не ясна. Если стоит задача количественного анализа суммы всех форм каротиноида, то просто используют ферм. гидролиз и HPLC-VIS, если только суммы эфиров каротиноида, то HPLC-VIS без гидролиза и HPLC-VIS c гидролизом и т.д. При использовании "связки" LC-DAD-MS/MS необходимость в гидролизе в большинстве случаев отпадает. Так же эта необходимость отпадает при HPLC-VIS в некоторых ситуациях.

Если Вы хотите идентифицировать каротиноиды и их производные, а затем сделать колич. анализ, то Ваш подход весьма трудоемок. Для идентификации достаточно LC-DAD-MS/MS.

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

27.07.2011 // 18:23:15

Редактировано 1 раз(а)

virtu пишет:
Значит эфиров каротиноидов в 2 фракциях нет, если я правильно понял.

При делении в тонком слое (sorbfil, гексан:эфир 85:15 об/об) сняли три окрашенных зоны - первая ушла с фронтом - она ярко оранжевая. Омыляемых липидов не содержит - LC-DAD до омыления и после совпали на 100%, а вот идентифицировать ее не удается. Очень похоже на предшественники каротиноидов.
Вторая фракция оказалась на уровне 1/5 пластинки от линии старта. Омыляемые липиды содержали хороший пул жирных кислот, а вот неомыляемые рассыпались на лес мелких пиков - т.е. пигменты не выдержали омыления - тут мы промахнулись с условиями.
Третья взята со старта (тоже ошибка, так-то), но до омыления и после оного LC-DAD дают идентичные хроматограммы, только времена удерживания сдвигаются на несколько минут раньше. То есть, там тоже есть этерифицированные каротиноиды, которые выдерживают жесткие условиях щелочного гидролиза.

Возможности для LC-DAD-MS/MS у нас нет - в институте отсутствует подобное оборудование..
Вопрос в том, можно ли заменить ферментативный гидролиз щелочным, но в течение 3-4 часов, например, при комнатной или пониженной температуре? Основная задача - установить пул каротиноидов и какие жирные кислоты их этерифицируют, а затем поглядеть есть ли корреляции между ЖК-составом каротиноидов и другими ацилсодержащими липидами в исследуемом объекте.

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

27.07.2011 // 19:50:15

Редактировано 2 раз(а)

Chamomillablue пишет:

При делении в тонком слое (sorbfil, гексан:эфир 85:15 об/об) сняли три окрашенных зоны - первая ушла с фронтом - она ярко оранжевая. Омыляемых липидов не содержит - LC-DAD до омыления и после совпали на 100%, а вот идентифицировать ее не удается. Очень похоже на предшественники каротиноидов.

Должны быть каротины. УФ-ВИД-спектры ни на что известное не похожи?

Вторая фракция оказалась на уровне 1/5 пластинки от линии старта. Омыляемые липиды содержали хороший пул жирных кислот, а вот неомыляемые рассыпались на лес мелких пиков - т.е. пигменты не выдержали омыления - тут мы промахнулись с условиями.

Попробуйте сделать гидролиз при 20-30оС/4-5ч (0.1-0.3М КОН). Параллельно, тот же сэмпл при 20-30оС/4-5ч с пониженной концентрацией КОН (до 0.02-0.05М). В принципе, один или оба варианта должны прокатить. Но это "рядом не стояло" с ферментативным гидролизом (рекавери, эффективность и т.д.).

Попробуйте снизить концентрацию КОН до 0.02-0.05М и уменьшить время гидролиза до 20мин.

Постарайтесь использовать самый "чистый" (тяж. Ме и т.д.) КОН (из того что есть).

Третья взята со старта (тоже ошибка, так-то), но до омыления и после оного LC-DAD дают идентичные хроматограммы, только времена удерживания сдвигаются на несколько минут раньше. То есть, там тоже есть этерифицированные каротиноиды, которые выдерживают жесткие условиях щелочного гидролиза.

Если только эфиры коротких ЖК (С2-С4), хотя, это маловероятно, особенно, если Вы никак не контролируете/проверяете "дельту" времени удерживания. Более вероятно - это свободные или частично модифицированные ксантофиллы.

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

ANCHEM.RU
Интернет-портал химиков-аналитиков ANCHEM.RU – это профессиональный интернет-ресурс, объединяющий людей и организаций, работающих в области химического анализа, сертификации и метрологии.

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

27.07.2011 // 20:17:20

Редактировано 2 раз(а)

virtu пишет:
Должны быть каротины. УФ-ВИД-спектры ни на что известное не похожи?

Вот тут: files.mail.ru/505GE1 выложены пдф с картинками спектров этой фракции. Приведены спектры трех главных пиков.
Если бы найти препаративный ВЭЖХ и собрать эти три фракции, можно было бы на ESI-MS сунуться - это бы облегчило понимание... Но это все мечты )))
А вот тут: files.mail.ru/M4XYHV - со стартовой зоны.

Сегодня удалось подобрать систему, чтобы сдвинуть пигменты со старта и отделить их при этом от других, неокрашенных липидов.
Пока это только прицельные опыты - отрабатываем методику, пробуем разные варианты и подходы )

UPD: Нашел у нас залежи панкреатической липазы из поджелудочной железы свиньи, интересно, ей можно для гидролиза каротиноидов пользоваться?..

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

28.07.2011 // 12:15:11

Редактировано 1 раз(а)

Chamomillablue пишет:

Вот тут: files.mail.ru/505GE1 выложены пдф с картинками спектров этой фракции. Приведены спектры трех главных пиков.

Посмотрел, УФ-ВИД спектр первого пика похож на all-(E)-beta-carotene, но не совсем (соотн. интенсивностей первого и третьего максимума), остальное надо смотреть в лит-ре (+продукты деградации), однако УФ-ВИД спектр третьего пика, на мой взгляд, "нечистый" и второй, похоже, тоже.

Если бы найти препаративный ВЭЖХ и собрать эти три фракции, можно было бы на ESI-MS сунуться - это бы облегчило понимание... Но это все мечты )))

Это не тот случай. Судя по откликам (LC-DAD) данного количества нг/пик вполне хватит, чтобы получить нормальные масс-спектры при LC-ESI/APCI-MS(scan). Соотн. интенсивнойстей пиков здесь "наглядное", поэтому бояться изменения порядка выхода пиков здесь не стоит. (т.к. хром. систему придется использовать другую, с большой вероятностью).

А вот тут: files.mail.ru/M4XYHV - со стартовой зоны.

Да, "сдвиги" то приличные. Похоже на частично (по одному "концу") модифицированные ксантофиллы. Все-таки деградация имеет место быть (см. соотн. пиков). 2 и 3 пики - похожи на геом. изомеры (цис-транс), причем 3-цис.

UPD: Нашел у нас залежи панкреатической липазы из поджелудочной железы свиньи, интересно, ей можно для гидролиза каротиноидов пользоваться?..

Думаю, есть смысл попробовать, только оптимальные условия для этого фермента нужно в лит. посмотреть. Главное, чтобы он нормальный был.

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

28.07.2011 // 14:21:24

Редактировано 2 раз(а)

virtu, Спасибо, будем работать )
Найти бы LC/MS, хоть за $.. )

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

29.07.2011 // 10:53:51

Chamomillablue пишет:
Найти бы LC/MS, хоть за $.. )

Пишите, может быть помогу.
sav_analyst*lavabit.com

virtu
VIP Member
Ранг: 2135

05.07.2012 // 1:29:43


Ответов в этой теме: 11 Страница: 1 2 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты