Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 4. Химический форум ...
  4. Химический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Как растворить казеин в буфере? >>>

  Ответов в этой теме: 7

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Как растворить казеин в буфере?
ollo88
Пользователь
Ранг: 3

05.09.2012 // 19:21:13     
Здравствуйте, столкнулась с такой проблемой, в ряде иностранных статей приводится методика определения активности протеиназ с казеином в качестве субстрата, и во всех методиках его растворяют в том или ином буфере с рН 6,8-7,1, но как показывает практика казеин не растворяется в них, согласно литературным данным растворить его можно лишь в щелочах... как же быть если среда для работы фермента должна быть с рН 7, в щелочной среде он будет неактивен...
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
AA_Alex
Пользователь
Ранг: 371


06.09.2012 // 11:16:06     
Лучше использовать не казеин, а казеинат натрия (например такой - C8654 Sigma, Casein sodium salt from bovine milk). Он нормально растворяется в нейтральных буферах, например в PBS pH 7.4-7.5). чтобы растворить нужно часа 3-4 крутить на мешалке с небольшим подогревом - не выше 60.
Garry
VIP Member
Ранг: 1076


07.09.2012 // 16:44:24     
Редактировано 2 раз(а)


ollo88 пишет:
Здравствуйте, столкнулась с такой проблемой, в ряде иностранных статей приводится методика определения активности протеиназ с казеином в качестве субстрата, и во всех методиках его растворяют в том или ином буфере с рН 6,8-7,1, но как показывает практика казеин не растворяется в них, согласно литературным данным растворить его можно лишь в щелочах... как же быть если среда для работы фермента должна быть с рН 7, в щелочной среде он будет неактивен...
Покупаете казеин по Гаммерстену. Навеску этого казеина заливаете на ночь 30 мл фосфатного буфера рН 7,1 и даете возможность ему набухнуть в холодильнике. На следующий день нагреваете 60 мл того же но чистого фосфатного буфера до кипения. При равномерном кипении чистого буфера вливаете порциями суспензию набухшего казеина из холодильника и при помешивании доводите до кипения. Убираете нагрев, охлаждаете и фильтруете и доводите до метки 100мл фосфатным буфером. Можно добавить азид натрия (0,01%), чтобы в растворе субстрата не появились не желанные любители протеина . Раствор субстрата хранят в холодильнике до появления видимой взвеси. Как только она появилась, прийдется варить казеин заново.

Ну а далее все тривиально просто : буфер+исследуемый раствор ..... инкубация при 36 С минут 5, затем по секундомеру раствор казеинового субстрата .... инкубация минут 15-30 по секундомеру... опять же по секундомеру останавливаете реакцию 5% ТХУ.... фильтруете. Да, чуть не забыл, параллельно холостая проба с буфером-экстрагентом протеаз в исследуемом растворе вместо раствора протеаз - контроль на реактивы
ollo88
Пользователь
Ранг: 3


20.09.2012 // 17:05:19     
огромное вам спасибо за ответ!!!! очень помогли!
metrim
Пользователь
Ранг: 646


13.07.2013 // 17:01:50     
"Покупаете казеин по Гаммерстену."
Кстати говоря, есть у меня несколько советских банок с ентим делом запечатанных.
Гуглю, есть ппредложения по продаже, но что то ни единого описания препарата: что это, как, из чего - не попадается. Подскажите пожалуйста.

Ну и еще вопрос: Идет описание приготовления стандарта. И этап фильтрации, т.е. вроде как потеря какой то неизвестной части вещества. Как при этом говорить о титре ??
Garry
VIP Member
Ранг: 1076


14.07.2013 // 20:29:25     

metrim пишет:
"Покупаете казеин по Гаммерстену."
Кстати говоря, есть у меня несколько советских банок с ентим делом запечатанных.
Гуглю, есть ппредложения по продаже, но что то ни единого описания препарата: что это, как, из чего - не попадается. Подскажите пожалуйста.

Ну и еще вопрос: Идет описание приготовления стандарта. И этап фильтрации, т.е. вроде как потеря какой то неизвестной части вещества. Как при этом говорить о титре ??

Казеин, естественно из молока делают. Он выступает в качестве субстрата при определении активности протеиназ или их ингибиторов. Титр не имеет значения, поскольку субстрат обычно добавляется с некоторым избытком. При фильтрации отделяют механическую нерастворимую взвесь из нерастворимых белков, механических примесей (мусор ).
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Атомно-абсорбционные спектрометры Varian AA140/AA240 Атомно-абсорбционные спектрометры Varian AA140/AA240
Атомно-абсорбционные спектрометры данной серии представляют собой однолучевой (AA140) или двухлучевой (AA240) прибор среднего класса, объединяющий в себе высокий уровень автоматизации и простое программное обеспечение.
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
metrim
Пользователь
Ранг: 646


14.07.2013 // 21:02:27     

Garry пишет: Титр не имеет значения, поскольку субстрат обычно добавляется с некоторым избытком.
Ааа. Тупанул. Я то предполагал использовать для калиброочной шкалы на определение белка.

А вот что означает это самое "по Гаммерстену" ?
Что за методика то изготовления такая ?
Garry
VIP Member
Ранг: 1076


15.07.2013 // 9:46:58     

metrim пишет:

Garry пишет: Титр не имеет значения, поскольку субстрат обычно добавляется с некоторым избытком.
Ааа. Тупанул. Я то предполагал использовать для калиброочной шкалы на определение белка.

А вот что означает это самое "по Гаммерстену" ?
Что за методика то изготовления такая ?

Детали не знаю, но обычно казеин хреново растворяется, поэтому его обрабатывают определенным образом для придания ему некоторой растворимости в слабощелочных растворах. Скорее всего осажденный казеин перерастворяют щелочи, а затем или осаждают холодным ацетоном или высаливают, высушивают и получают сей продукт. Для калибровки лучше БСА (бычий сывороточный альбумин) применять. В любой клинико-диагностической лаборатории найдется до фига не использованого БСА , который по идее должен использоваться при определении белков крови, но по факту медики не особенно любят строить калибровки а используют коэффициент (тангенс угла наклона линейной регрессии), который как они считают особым уточнениям не подлежит.... По крайней мере я с такими сталкивался и не один раз. Кстати раствор БСА - прозрачен, а вот казеин имеет основательную опалесценцию, поэтому думаю не очень подходит как раствор для определения белка. При определении протеаз, непрореагировавший казеин просто осаждают 5% ТХУ, а затем фильтруют и меряют оптическую плотность фильтрата при 280 нм или 260 нм. По сути в растворе присутствуют пептиды, имеющие в своем составе (зависит от протеазы) триптофан, тирозин,лизин, фенилаланин, метионин.

  Ответов в этой теме: 7

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты