| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 4. Химический форум ... |
 |
Как растворить казеин в буфере? >>>
|
 |
| Автор | Тема: Как растворить казеин в буфере? | |||||
|
ollo88 Пользователь Ранг: 3 |
 05.09.2012 // 19:21:13
Здравствуйте, столкнулась с такой проблемой, в ряде иностранных статей приводится методика определения активности протеиназ с казеином в качестве субстрата, и во всех методиках его растворяют в том или ином буфере с рН 6,8-7,1, но как показывает практика казеин не растворяется в них, согласно литературным данным растворить его можно лишь в щелочах... как же быть если среда для работы фермента должна быть с рН 7, в щелочной среде он будет неактивен... |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
AA_Alex Пользователь Ранг: 372 |
06.09.2012 // 11:16:06
Лучше использовать не казеин, а казеинат натрия (например такой - C8654 Sigma, Casein sodium salt from bovine milk). Он нормально растворяется в нейтральных буферах, например в PBS pH 7.4-7.5). чтобы растворить нужно часа 3-4 крутить на мешалке с небольшим подогревом - не выше 60. |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
07.09.2012 // 16:44:24
Редактировано 2 раз(а) Покупаете казеин по Гаммерстену. Навеску этого казеина заливаете на ночь 30 мл фосфатного буфера рН 7,1 и даете возможность ему набухнуть в холодильнике. На следующий день нагреваете 60 мл того же но чистого фосфатного буфера до кипения. При равномерном кипении чистого буфера вливаете порциями суспензию набухшего казеина из холодильника и при помешивании доводите до кипения. Убираете нагрев, охлаждаете и фильтруете и доводите до метки 100мл фосфатным буфером. Можно добавить азид натрия (0,01%), чтобы в растворе субстрата не появились не желанные любители протеина  . Раствор субстрата хранят в холодильнике до появления видимой взвеси. Как только она появилась, прийдется варить казеин заново.Ну а далее все тривиально просто : буфер+исследуемый раствор ..... инкубация при 36 С минут 5, затем по секундомеру раствор казеинового субстрата .... инкубация минут 15-30 по секундомеру... опять же по секундомеру останавливаете реакцию 5% ТХУ.... фильтруете. Да, чуть не забыл, параллельно холостая проба с буфером-экстрагентом протеаз в исследуемом растворе вместо раствора протеаз - контроль на реактивы |
|||||
|
ollo88 Пользователь Ранг: 3 |
20.09.2012 // 17:05:19
огромное вам спасибо за ответ!!!! очень помогли! |
|||||
|
metrim Пользователь Ранг: 646 |
13.07.2013 // 17:01:50
"Покупаете казеин по Гаммерстену." Кстати говоря, есть у меня несколько советских банок с ентим делом запечатанных. Гуглю, есть ппредложения по продаже, но что то ни единого описания препарата: что это, как, из чего - не попадается. Подскажите пожалуйста. Ну и еще вопрос: Идет описание приготовления стандарта. И этап фильтрации, т.е. вроде как потеря какой то неизвестной части вещества. Как при этом говорить о титре ?? |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
14.07.2013 // 20:29:25
Казеин, естественно из молока делают. Он выступает в качестве субстрата при определении активности протеиназ или их ингибиторов. Титр не имеет значения, поскольку субстрат обычно добавляется с некоторым избытком. При фильтрации отделяют механическую нерастворимую взвесь из нерастворимых белков, механических примесей (мусор ).
|
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
metrim Пользователь Ранг: 646 |
14.07.2013 // 21:02:27
Ааа. Тупанул. Я то предполагал использовать для калиброочной шкалы на определение белка. А вот что означает это самое "по Гаммерстену" ? Что за методика то изготовления такая ? |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
15.07.2013 // 9:46:58
Детали не знаю, но обычно казеин хреново растворяется, поэтому его обрабатывают определенным образом для придания ему некоторой растворимости в слабощелочных растворах. Скорее всего осажденный казеин перерастворяют щелочи, а затем или осаждают холодным ацетоном или высаливают, высушивают и получают сей продукт. Для калибровки лучше БСА (бычий сывороточный альбумин) применять. В любой клинико-диагностической лаборатории найдется до фига не использованого БСА , который по идее должен использоваться при определении белков крови, но по факту медики не особенно любят строить калибровки а используют коэффициент (тангенс угла наклона линейной регрессии), который как они считают особым уточнениям не подлежит.... По крайней мере я с такими сталкивался и не один раз. Кстати раствор БСА - прозрачен, а вот казеин имеет основательную опалесценцию, поэтому думаю не очень подходит как раствор для определения белка. При определении протеаз, непрореагировавший казеин просто осаждают 5% ТХУ, а затем фильтруют и меряют оптическую плотность фильтрата при 280 нм или 260 нм. По сути в растворе присутствуют пептиды, имеющие в своем составе (зависит от протеазы) триптофан, тирозин,лизин, фенилаланин, метионин. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 7 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
