Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Регенерация от ПАВ колонки Zorbax GF-250 >>>

  Ответов в этой теме: 4

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Регенерация от ПАВ колонки Zorbax GF-250
Алексей (СамГУ)
Пользователь
Ранг: 367

24.08.2016 // 18:07:33     
Коллеги, возможно кто-то имел подобный опыт. Разделяли белки с добавкой в подвижную фазу ПАВ - лаурилсаркозинат натрия. Потом потребовалось делить белки в ПФ обычных (буфер , соль), перед эти решили хорошо колонку отмыть (вода, вода-изопропанол, 0.1 % ТФУ, от 20-90%) и оказалась , что белки (такие как BSA , OVA т.д.) не элюируются из колонки , т.е. колонка стала белки адсорбировать, хотя любая низкомолекулярная полярщина выходит нормально. Понятно , что причина в ПАВ, и производитель колонки пишет, что если уж вы добавили в ПФ ПАВ такие как SDS, то лучше теперь для таких ПФ ее только и использовать. Конечно, как вариант, это разок промыть колонку 0.1 N NaOH , хотя конечно опасно ... Вобщем перед этим мне хотелось бы услышать ваше экспертное мнение, может кто с таким сталкивался.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


24.08.2016 // 23:01:12     
Редактировано 1 раз(а)

С такой ситуацией (ПАВ и сорбент) никогда не сталкивался, но попробовал бы следующее:

1. MeOH (100%)

2. MeOH/MeCN : 0.2-0.4%v TEA/DEA (триэтиламин/диэтиламин в воде) от 2:1 до 4:1
Алексей (СамГУ)
Пользователь
Ранг: 367


25.08.2016 // 13:35:05     

virtu пишет:
С такой ситуацией (ПАВ и сорбент) никогда не сталкивался, но попробовал бы следующее:

1. MeOH (100%)

2. MeOH/MeCN : 0.2-0.4%v TEA/DEA (триэтиламин/диэтиламин в воде) от 2:1 до 4:1


Спасибо за совет! Попробуем. Пока делали следующие:
1. промывка 20 mM Трис (pH=8), 0.2 M аргинин. Базовая линия плыла, то есть явно с колонки что-то смывалось. Белки сидят прочно на колонке, выходит только B12
2. потом промывка 20 mM Трис (pH=8), 0.2 NaCl. Базовая линия очень стабильная, белки вообще не выходят , зато B12 выходит более симметричным пиком
3. далее мыли мочевина 8М, фосфатный буфер 0.1М (pH=7.5). Появились белки , но не все(!). Правда эффективность колонки не очень.
4. решил законсервировать колонку 0.1 Na2HPO4 (ph=7), 0.005% NaN3. И за одно решил проверить как делится смесь белков ,и О! Чудо! Появились все белки , хотя высота пиков и эффективность разделение желают лучшего. Прогнал 500 мл данной ПФ и еще раз прогнал смесь, обнаружил что колонке продолжает легчать. Просто прогнал белок BSA, выходит! , но эффективность разделения не очень.

Смесь белков от Био РАД, Da:
Thyroglobulin (bovine) 670,000
γ-globulin (bovine) 158,000
Ovalbumin (chicken) 44,000
Myoglobin (horse) 17,000
Vitamin B12 1,350

Получается , что мочевина рулит !!
AA_Alex
Пользователь
Ранг: 371


26.08.2016 // 7:19:58     

Спасибо за совет! Попробуем. Пока делали следующие:

3. далее мыли мочевина 8М, фосфатный буфер 0.1М (pH=7.5). Появились белки , но не все(!). Правда эффективность колонки не очень.
4. решил законсервировать колонку 0.1 Na2HPO4 (ph=7), 0.005% NaN3. И за одно решил проверить как делится смесь белков ,и О! Чудо! Появились все белки , хотя высота пиков и эффективность разделение желают лучшего. Прогнал 500 мл данной ПФ и еще раз прогнал смесь, обнаружил что колонке продолжает легчать. Просто прогнал белок BSA, выходит! , но эффективность разделения не очень.



Вообще-то производитель рекомендует:
back-flush the column (after reassembly) with 30% isopropanol; 30% isopropanol with 1mM EDTA (pH 4.5); or 50% acetonitrile, containing 0.05% TFA. This last cleaning procedure is quite stringent and may restore column performance. If not, you can assume that the column has been compromised beyond repair.
https://www.google.ru/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0ahUKEwjSzNDymd7OAhVD1iwKHav2DMAQFgglMAE&url=https%3A%2F%2Fwww.chem.agilent.com%2Fcag%2FProd%2FCA%2FGF250-884972-001.pdf&usg=AFQjCNEFKZrMS7mx7AZ63-Yby_rr6CtDqg&bvm=bv.131286987,d.bGg&cad=rjt

А для хранения ГФ-колонок я использую 0,02 или 0,05% азид (это стандартные рекомендации для ГФ-колонок типа TSK-gel, Bio-Sep и т.п.)
Алексей (СамГУ)
Пользователь
Ранг: 367


29.08.2016 // 10:24:56     
Редактировано 2 раз(а)


AA_Alex пишет:

Спасибо за совет! Попробуем. Пока делали следующие:

3. далее мыли мочевина 8М, фосфатный буфер 0.1М (pH=7.5). Появились белки , но не все(!). Правда эффективность колонки не очень.
4. решил законсервировать колонку 0.1 Na2HPO4 (ph=7), 0.005% NaN3. И за одно решил проверить как делится смесь белков ,и О! Чудо! Появились все белки , хотя высота пиков и эффективность разделение желают лучшего. Прогнал 500 мл данной ПФ и еще раз прогнал смесь, обнаружил что колонке продолжает легчать. Просто прогнал белок BSA, выходит! , но эффективность разделения не очень.



Вообще-то производитель рекомендует:
back-flush the column (after reassembly) with 30% isopropanol; 30% isopropanol with 1mM EDTA (pH 4.5); or 50% acetonitrile, containing 0.05% TFA. This last cleaning procedure is quite stringent and may restore column performance. If not, you can assume that the column has been compromised beyond repair.
https://www.google.ru/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0ahUKEwjSzNDymd7OAhVD1iwKHav2DMAQFgglMAE&url=https%3A%2F%2Fwww.chem.agilent.com%2Fcag%2FProd%2FCA%2FGF250-884972-001.pdf&usg=AFQjCNEFKZrMS7mx7AZ63-Yby_rr6CtDqg&bvm=bv.131286987,d.bGg&cad=rjt

А для хранения ГФ-колонок я использую 0,02 или 0,05% азид (это стандартные рекомендации для ГФ-колонок типа TSK-gel, Bio-Sep и т.п.)
Это, конечно, вы правы. И конечно, инструкция к данной колонке была нами изучена вдоль и поперек ) Но следует заметить, что описанный способ регенерации колонки дан для случая очистки колонки от белков и всего такого , а не от ПАВ, как в моем конкретном случае. Что касается применения ПАВ в ПФ, то в инструкции сурово написано : если уж применили, то теперь только так ее и используйте. И конечно, правильно бы было купить просто 2-е колонки и не парится , но это непросто в условиях российской действительности.
Что касается концентрации азида, которую вы используете .. по-моему его концентрация высоковата, рекомендуют 0.005%, т.е. в 10 раз меньше.

  Ответов в этой теме: 4

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты