Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

разделение фрагментов ДНК >>>

  Ответов в этой теме: 7

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: разделение фрагментов ДНК
kim2006
Пользователь
Ранг: 3

06.06.2006 // 13:46:21     
Глубокоуважаемые форумчане,
Если у кого есть опыт в данном вопросе, помогите, пожалуйста!
Ситуация следующая. Пытаюсь разделить фрагменты ДНК на хроматографе. Колонка вариановская, HELIX DNA COLUMN CP28353 (50 X 3.0 мм) - к своему глубокому стыду, я ровным счетом ничего не знаю об этой колонке (просто нет никакой информации - ни в описании, ни на сайте Varian). Единственное, что известно - то, что она "performs very well for non-denaturing applications of dsDNA, is silica based, is also good for DHPLC...". Ну то есть, очевидно, к силикагелю пришиты какие-то алкилы, вероятно, что силикагель непористый, но какой именно и какова длина алкилов - неизвестно. Вариант хроматографии - ион-парная обращенно-фазная: 0.1М ТЕАА (раствор С) и 0.1М ТЕАА + 50 об.% ацетонитрила (раствор D). Градиент: от 7 до 30 % раствора D в смеси С и D за 25 минут, а вообще-то я прошла все возможные варианты градиента (начиная от чистого раствора С) и составов растворителя. Температура: от 25 С до 62 С.
Проблема в том, что при указанных условиях прекрасно делятся одноцепочечные нуклеиновые кислоты (олигонуклеотиды и tРНК, время удерживания, допустим, 20 bp-олигонуклеотида примерно 22 мин. при комнатной температуре и примерно 16 мин при 62 С), а вот двухцепочечная ДНК пролетает, не задерживаясь на колонке совершенно (время удерживания 0.9 мин). Изменение градиента, как я сказала, не помогает. Температура на время выхода ДНК тоже никак не влияет. Длина используемых фрагментов ДНК была 166 и 600 bp. Ну не понимаю, в чем тут дело!
Боюсь, что я совсем неопытный хроматографист, поэтому если поможете советом - буду очень благодарна!
Заранее спасибо,
kim.
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


07.06.2006 // 12:58:01     

Ну вот видите, все сами и сказали - ион-парная обращенка Это если TEAA - это тетраэтиламин, а не триэлиламин. Если что-то не удерживается, то на это может быть аж три причины. Приведу их порядке убывания вероятности реализации.

1. Фосфатные группы "заняты", их меньше и т.д., то есть отрицательный заряд молекулы меньше.
2. Молекулы значительно менее гидрофобны (или более гидрофильны).
3. Молеклы настолько большие, что уже не влазят в поры.

Удерживание здесь - комбинация этих трех причин. Так что думайте что подходит. Если дело в причине 1, то ситуацию можно исправить. Если 2 и 3 - только на другой колонке.

КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


07.06.2006 // 13:07:09     
Редактировано 2 раз(а)

Да... 0.9 минут для такой колонки - это вполне удерживание, даже на скорости 0.5 мл/мин, не говоря о кубике. Ноль у нее всего-то микролитров 200-300...

И соврал я насчет причины 2. И тут можно побороться.

Итак, если 1, то возьмите тетрабутиламмоний вместо тетраэлиламмония.

Если 2, то возьмите слабый элюент (он будет сильным) и добавьте 100мМ соли (этот теперь будет слабым) и посмотрите чего выйдет.
Это не очень удобный метод, но, как видно, иногда бывает нужно Называется гидрофобная хроматография (HIC - hidrophobic interaction chrom.)
kim2006
Пользователь
Ранг: 3


09.06.2006 // 16:12:18     
Спасибо большое за ответ!
Если можно, я поясню.
ТЕАА - это ацетат ТРИэтиламмония. Насколько я поняла, читая всякую литературу (в основном англоязычную), сложились некоторые "стандартные" условия разделения фрагментов ДНК (более конкретно - DHPLC, то есть попросту при температуре начала денатурации данного фрагмента) на обращенной фазе . Условия эти следующие. Элюэнт - смесь двух растворов: 1-й - 0.1 М ТЕАА (ацетат триэтиламмония), рН 7; 2-й - 0.1 М ТЕАА плюс 25% ацетонитрила. Градиент - где-то от 20 до 40% раствора 2 на скорости потока где-то 0.5 мл/мин. Колонка - С8(С18)/непористый полистирол-дивинилбензол или С8(С18)/непористый силикагель. В этих уловиях делят ДНК в 95% ВСЕХ СЛУЧАЕВ РАЗДЕЛЕНИЯ ДНК в мире. И говорят, что работает :о)
Я пытаюсь повторить ровно то же самое. С дословным воспроизведением этих самых условий. С новой колонкой, про которую заявлено, что она разработана как раз для деления ДНК и для DHPLC. И у меня оно НЕ РАБОТАЕТ!
Конечно, я тоже сразу начинаю думать о гидрофобных свойствах и т.п., но перед тем как добывать другой растворитель и изображать чудеса ловкости, пытаясь разделить ДНК любой ценой, хотелось бы понять - ПОЧЕМУ оно у меня не работает. Есть сильное подозрение, что я, как начинающий хроматографист, попросту чего-то не вижу или неправильно понимаю - возможно, это какой-то сущий пустяк, из-за которого ничего и не получается. Дорогие коллеги, если есть какие-то соображения, замечания, вопросы по данному предмету - пожалуйста, напишите!!! Может, натолкнет на какую-нибудь идею...
И, если можно, несколько вопросов по возможным дальнейшим действиям.
1. По поводу гидрофобности одноцепочечных и двухцепочечных нуклеиновых кислот. Насколько я знаю (возможно, не права!), РНК считается более гидрофобной, чем ДНК. Гидрофобные свойства нуклеиновым кислотам придают гетероциклические основания, гидрфильные - рибоза и фосфаты. У ДНК основания "внутри" - может быть, из-за этого она более гидрофильна?
Однако если ДНК более гидрофильна, то она должна лучше взаимодействать с ТЕАА и, следовательно, лучше удерживаться на колонке, чем РНК (у меня все как раз наоборот)? Это так?
2. Константин, не могли бы Вы пояснить Вашу фразу "даже на скорости 0.5 мл/мин, не говоря о кубике"? Я работаю на 0.45 мл/мин и была уверена, что чем меньше скорость потока, тем лучше разделение?
3. Если можно, поясните, пожалуйста, еще вариант со слабым элюэнтом (какой конкретно взять?) и солью (какой?). Что это за механизм?
Спасибо!
С уважением,
kim
Gamer
Пользователь
Ранг: 10


11.06.2006 // 8:07:57     
Ну, если у вас "прекрасно делятся олигонуклеотиды" в 22 пары (и при этом требуется 22 же минуты), то как вы рассчитываете разделить ваши 166 пар в тех же условиях? Судя по маркировке, ваша колонна и система проверяется по результатам дайджеста HaeIII вектора pUC 18. Вы это пробовали выполнить? Или так, наобум начали?... В приниципе, тоже сойдет...
Исходя из основ DHPLС, удерживание нативных двунитевых фрагментов должно быть больше удерживания диссоциированных цепей. Чем длиннее фрагмент, тем больше доли CH3CN требуется для элюирования.
Вообще-то, технику DHPLC пытаются использовать для обнаружения мутации на одной из цепей, исходя из приниципа, что фрагменты с заменой на одной из цепей(гетеродуплексы) должны диссоциировать при меньшей температуре, чем немутировавшие (гомодуплексы).
Ну, а если вы вообще не видите фрагменты 600 пар, увеличивайте градиент. Чудес же не бывает. У вас или процент ацетонитрила неверный или еще какая бодяга. Температуру подкиньте немного. Может, вы просто не детектируете по причине мизерного количества?
Gamer
Пользователь
Ранг: 10


11.06.2006 // 8:13:28     
Редактировано 1 раз(а)

Что касается условий, то у вас все абсолютно верно подобрано. (Только необязательно меньшая скорость даст лучшее разрешение- но Вариан советует именно 0,45-0,5 мл/мин).
Ион-парный реагент ТЕАА заменить на классический ион-парный не удастся (хуже взаимодействуют с НК), да и ни к чему это.
Температура влияет на "цепочечность" НК, а потому должна влиять и на время выхода (ну, конечно, не того, что выходит за 0,9 мин).
Вы должны учитывать банальное уширение пиков и снижение чувствительности при анализе длинных фрагментов. Какими количествами вы оперируете и насколько прозрачен в УФ ваш ацетонитрил? Наконец, из того, что вам удавалось разделить- проявлялась хоть какая-нибудь зависимость удерживания от длины?

В общем, эту проблему из форума, просто так, не решить. Начните со стандартной проверки.
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
ААС Спектрометр Varian АА240Z ААС Спектрометр Varian АА240Z
Спектрометры Varian AA240Z/280Z являются новейшим поколением приборов с коррекцией Зеемана и отличаются наилучшей чувствительностью, производительностью и , в то же время, удобным и интуитивно понятным программным обеспечением.
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
kim2006
Пользователь
Ранг: 3


13.06.2006 // 11:45:19     
Gamer, спасибо большое за совет!
Да, все верно - в тест-сертификате указан pUC18 HaeIII, разделение при 50 С на 0.45 мл/мин, фрагменты 257 и 267 bp делятся примерно на 4.5 мин. Странно, что мне не пришло в голову сразу проверить этот тест! Хотя начала я все-таки не совсем наобум: все же обработала колонку растворителями при разных температурах...
Чудес не бывает, согласна (в том и проблема!) - поэтому меня так сильно и смущает, что при ЛЮБЫХ количествах ацетонитрила я ДНК не вижу. Градиент меняла в таких пределах: 7-25%D/25 мин, 7-35%D/25 мин, 7-50%D/25 мин, 7-75%D/25 мин, 7-80%D/25 мин, 7-100%D/25 мин; 22-46%D/25 мин (условия Varian) и далее по возрастающей; от чистого раствора С до чистого D за разное время. Результат одинаковый: единственный пик на 0.9 мин.
Количество вводимой ДНК варьировала. У меня петля 20 мкл, а концентрация растворов ДНК была от 4 нг/мкл до 100 нг/мкл (с учетом объема петли это, соответственно, от 80 до 400 нг в пробе, а чувствительность данного метода, насколько я понимаю, до 10 нг ДНК в пробе). Зависимость интенсивности того самого пика на 0.9 мин от концентрации ДНК более чем четкая.
Что касается ацетонитрила: для ВЭЖХ, 210 нм. Я работаю на стандартной длине волны 254 нм.
Зависимость удерживания от длины: могу судить только по tРНК (это же ведь набор одноцепочечных фрагментов длиной 60-80 оснований, так?), которая на моей колонке замечательно делится при самых разных условиях.
С уважением,
kim
КонстантинС
VIP Member
Ранг: 2306


13.06.2006 // 14:40:36     
Редактировано 2 раз(а)

Ну, я вижу, вы тут все уже решили

Пик на 0.9 может быть пиком вытеснения триэтиламина. Попробуйте вколоть буфер, в котором держите ДНК, или водичку с ацетонитрилом - появится этот пик?

Так что пока гипотеза - что все-таки почему-то не видите. Попробуйте разок ацетонитрил поднять посильнее (ну, пусть денанурируется - шут с ним), или вообще поколось на сильном элюенте в изократике. Если не появится, то следующая гипотеза - что не видите.

0.5 кубика - нормально.

Почитал все повнимательнее.. "Ну, если у вас "прекрасно делятся олигонуклеотиды" в 22 пары (и при этом требуется 22 же минуты), то как вы рассчитываете разделить ваши 166 пар в тех же условиях?"

Эт точно, просто Ваша ДНК сидит на колонке. Возьмите сначала чистый D или вообще чистый ацетонитрил и помойте колонку. Потом поколите на чистом D в изократике.

  Ответов в этой теме: 7

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты