| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Экстракция и очистка фитогормонов для гх-мс >>>
|
 |
| Автор | Тема: Экстракция и очистка фитогормонов для гх-мс | |||||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
 18.09.2008 // 11:44:25
Помогите, пожалуйста, разобраться с пробоподготовкой фитогормонов из растительной матрицы к ГХ-МС. Из навески образца 5 г гомогенизированного в жидком азоте проводим экстракцию в течение часа (регулярно помешивая) (целевые соединения - абсцизовая кислота и индол-3-уксусная кислота, ИУК) 80% охлажденным до 4 град метанолом. В экстракты добавлен антиоксидант (ДТК и ЭДТА). Раствор центрифугируем (1200 g) 10 мин при 4 град и осадок экстрагируем повторно. Супернатанты объединяем и экстрагируем пигменты и липидные компоненты хлороформом и гексаном последовательно . Раствор выпариваем при 35-45 град до водного остатка и доводим pH до 3 фосфатным буфером. Фитогормоны экстрагируем диэтиловым эфиром (или этилацетатом) трижды и обезвоживаем эфирную фракцию Na2SO4 . Эфир выпариваем при 35 град, перерастворяем осадок в 200 мл метанола и либо проводим ТСХ очистку (система хлороформ-этилацетат-уксусная кислота 100:100:1). RF-0,5-0,9. Силикагель смываем этилацетатом, упариваем до 500 мкл и силилируем при 90 град 30 мин. В другом варианте перед дериватизацией очищаем в патронах ТФЭ. Патроны ДИАПАК С16, объем 2 мл. Сорбент выбрали согласно литературе. Стандарты искомых кислот через патрон пропускали. При хроматографировании почти всегда получали приличные пики. Однако были пара случаев, когда стандарт исчезал в патроне.Буфер на этапе подготовки патрона - 6 мл 0,1 М KH2PO4(pH 2.7). Ожидаемые концентрации от 10 нг до 1 мкг на мл. Результат безрадостный - от 1-2 проб слабый сигнал, от 50 - никакой. На самом деле мы перепробовали много вариантов экстракции и очистки, все не опишешь, но без особого успеха. Образцами служили как свежие листья яблони, так и хранившиеся в кельвинаторе при минус 69 град. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Farma Пользователь Ранг: 382 |
18.09.2008 // 16:30:21
Из Вашего весьма подробного текста следует, что Вы наносите фитогормоны на С16 патрон из этилацетата  Считайте, что на основную Вашу ошибку я уже указал. Почитайте теорию ТФЭ или сходите на курсы по ТФЭ. |
|||||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
19.09.2008 // 4:45:17
Все же текст получился недостаточно подробный. Не наносим мы фитогормоны на С16 патрон из этилацетата, но из 0,1 М K2PO4. Может еще какие-то ошибки просматриваются? Курсов по ТФЭ у нас в дальних краях нет. Делаем по по лит. данным, напр. Liu, S. and Tillberg, E. Physiol.Plants, 57:441-447 (1987), Gaskin, P., MacMillan, Methodoly..."(1992), Birkemeyer, et all, Max-Plank-Institute (J. of Chromatography, 2003, ) и т.д., в том числе и по прописям на сайтах фирм-производителей. Я понимаю, что методика наша производит впечатление весьма эклектичной, но она такая и есть. Это результат того, что мы пробовали так и эдак, что-то переносили из других методик, но стабильного хорошего результата, увы, не получили. |
|||||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
19.09.2008 // 5:18:19
С учетом того, что оба целевых вещества весьма полярны и к тому же слабые кислоты, лучше использрвать ТФЭ не на обращенке (С16), а на смешанном анионо-обменном сорбенте, типа Oasis MAX (Waters). При этом у Вас появится больше возможностей для промывки. Но и на обращенку из кислой среды (р-р муравьиной кислоты) они тоже должны сесть. А пытаться кислоты посадить на обращенку из щелочного раствора (0.1 M K2HPO4) - это, простите, из области фантастики. |
|||||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
19.09.2008 // 5:40:06
Огромное Вам спасибо за совет и информацию, будем пробовать. Всяческих успехов. |
|||||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
19.09.2008 // 5:46:40
Да, и еще мы не из щелочной среды пропускали образец через патрон, мы после экстракции доводили pH буфера до 2,7 фосфорной кислотой. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
19.09.2008 // 10:03:01
Редактировано 2 раз(а) to LVD: Возникли некоторые мысли, может будут полезны: 1. Деструкция молекул. 2. «…80% охлажденным до 4 град метанолом» - А другие 20% об. - вода? На мой взгляд здесь можно попробовать метанол-этилацетат (что-то вроде 65:35 v/v% - здесь можно «поиграть»). 3. «Супернатанты объединяем и экстрагируем пигменты и липидные компоненты хлороформом и гексаном последовательно» - Хлороформ здесь, на мой взгляд, надо убрать. 4. Насчет ТФЭ – (Islander +) хотел добавить, что подготавливаете патрон (сорбент С16) для ТФЭ для этого случая неправильно и «промывочный элюент» выбран неадекватно, Вы писали: «Условия ТФЭ - кондиционирование метанолом, затем буфером (pH 2,7) после образца промывали метанол:вода 1:4 …» - Сделайте так: берете патрон с сорбентом, промывка метанолом 3-5 г.о.п.(геом.объем патрона,точнее объем занимаемый сорбентом), затем не менее 3 г.о.п. дист. воды, затем 4-5 г.о.п. «буфера» (или другого раствора, в котором будут растворены Ваши сорбаты, рекомендую или ионную силу «буфера» уменьшить до 0.05М или возьмите водный раствор органической кислоты, той же муравьиной, в этом случае дист. водой промывать не надо), затем – через патрон; в стадии промывки можно взять ту же смесь, только рН<рКа (ваших сорбатов), т.е. МеОН: X %v. HCOOHaq. 10-25:90-75 v./v.%, варианты «промывочных» смесей – дело фантазии и от чего хотите избавиться (Вам должно быть виднее) и главное не элюировать целевые сорбаты  .4. Может быть опрометчивый вопрос: Вы имитацию пробы делали или пробы с добавками? Просто таким образом, достаточно легко выявить «фатальные» этапы. С уважением, Алексей. З.Ы.: Если работаете с патронами "БХМ ст" - "Диапак" - у них есть руководство по ТФЭ на их сайте. Если есть потребность и желание, напишите на utriv{coбaчkа}mail.ru - когда будет время, скину некоторые материалы по ТФЭ. |
|||||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
19.09.2008 // 10:35:58
Большое спасибо, Алексей! Есть и потребность и желание. Будем Вам писать с Вашего разрешения. |
|||||
|
biometrology Пользователь Ранг: 25 |
19.09.2008 // 11:41:19
Коллега!Если не хотите больше мучаться с подобными пассажами - переходите на подход,который мною апробирован многократно,описан широко в литературе,как "ВСЕ В ОДНОМ ". Суть состоит в том,что последняя операция по дериватизации и является единственной и достаточной.Вам необходимо только 1.хорошо измельчить продукт 2.Проводить дериватизацию в присутствии сорастворителя,хорошо растворяющего продукт реакции.Я обычно это делаю в присутствии пиридина - ускоряет реакцию силилирования и одновременно участвует в экстракции. Все это проводится на мг-овых количествах вещества в 2 мл пузырьках для автосамплера (Например - фирмы Агилент).После проведения реакции -экстракции достаточно бывает просто осторожно перенести чистую часть пробы в другой пузырек.Следует заметить,что расчет проводится с учетом общего объема растворителя - который взят в реакцию.Возможен вариант - проводите реакцию,и только затем добавляете корастворитель,например толуол сушеный над сульфатом натрия. Удачи Александр |
|||||
|
Farma Пользователь Ранг: 382 |
19.09.2008 // 18:11:55
К сожалению, не могу писать подробно, так как сижу на чемоданах (в командировку улетаю), могу только предложить попробовать перейти на С18 или полистирольные патроны. Удерживание полярных соединений на них будет лучше, а стабильность полимера в кислых условиях по-любому выше. Это первое. Во-вторых я бы отработал версию уважаемого virtu (о деградации Вашего вещества ещё до ТФЭ) и попробовал бы сделать опыт со стандартным веществом (если таковое имеется). Прогоните раствор стандарта через все стадии пробоподготовки и посмотрите выход. |
|||||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
22.09.2008 // 5:54:44
Спасибо за очень интересную информацию, попробуем. Опасаемся только, что в реакционную часть перейдет все, кроме липидов, поскольку целевые компоненты водорастворимые, то полезут и сахара и пигменты |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
