| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Glycoforms of IFN b1a. LC ESI MS/MS. >>>
|
 |
| Автор | Тема: Glycoforms of IFN b1a. LC ESI MS/MS. | ||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
 11.06.2010 // 14:33:42
Редактировано 1 раз(а) Идентифицировать. 5-10ррм в биологической среде (каждого аналита - 6 гликоформ основных, номинальные м. массы известны 20-23кДа). "Игрался" с фармстандартом. ОФ-ВЭЖХ на Sil C18 (60мкл/мин, спрэй простой). 300-700нг на пик (из предположения, что в стандарте 6 гликоформ, хотя я в этом уже начинаю сомневаться) - в скане (+esi, 1200-2000 m/z) "ловил" пару пиков (s/n 4-8) - масс-спектр. разобрать невозможно, что и понятно. Прямая инфузия после соотв. очистки стандарта - "не радует" глаза, да и перспектива инсульта при деконволюции мс-спектра не радует. В общем, не хватает "чутья". Вопросы: 1. Имеет ли смысл пробовать "ловить" в форме аддуктов? 2. MRM переходы и их условия, где можно посмотреть (копался, но может не там ищу?)? 3. Может, есть какие-либо "хитрости" при работе с гликозилированными белками? С другими белками работал, но с концентрациями была другая ситуация, да и задачи другие. Спасибо всем откликнувшимся! |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
11.06.2010 // 17:31:12
Если бы вы более четко обозначили что вы хотите увидеть, было бы проще что то дельное подсказать. Я не думаю что здесь настолько много людей в IFN бизнесе что могут понять проблему с полуслова. В биол. препарате я бы (ИМХО) вообще не шел за интактными массами белков, но это может от незнания. Хотя, на недавней ASMS в Salt Lake City был толковый постер от Thermo где они показывали как надо оптимизировать MRM на интактных небольших белках, помоему там был трюк в том что надо идти за малыми collision energy и ловить transitions из многозарядных в многозарядные ионы. Поищите у них на сайте, мoжет уже постеры выложены в pdf. Если нет, дайте знать, я попробую отыскать, где то по моему CD с постерами уже ходили, или напишите сами локальным Thermo людям, у них должны уже быть |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
12.06.2010 // 16:16:34
Редактировано 1 раз(а) Дубль два. Задача: Идентифицировать 6 известных гликоформ ИФН с известной м.м. (20-23кДа) в биол. среде, ожидаемый диапазон концентраций 5-10ppm. План был такой: Standard. Scan (1000-2000m/z), Parent scan (1000-2000m/z>163, 204, 366 m/z)/SIR (163, 204, 366 m/z with fragmentation in ion source), Daughter scan (product ion scan) then creation of MRM method (я не собирался идти за интактными массами). Из предыдущего поста понятно, что дело остановилось на стадии Scan (1000-2000m/z). К остальным стадиям даже не ходил. Сразу скажу, что SIR по предикт ионам я не делал, т.к. считаю, что это "шило на мыло". При заколе (ожидаемая масса аналита в пике приведена выше) что-то детектируется (УФ 260-280нм - МС), но я не могу разобрать какие ионы дают вклад в TIC. Я сейчас прорабатываю версию "кривого" стандарта (новый, но интуиция мне подсказывает, что внутри может быть не то, что мне нужно, т.к. покупал и т.д. не я, а "заказчик"). Люди советовали попробовать в -ESI в виде аддуктов с формиат ионами (интуитивно, мне этот подход не приглянулся и я не пробовал). Соотв. понятны мои 1 и 3 вопросы (как увеличить эффективность ионизации или сигнал/шум), вопрос про MRM тоже. Можно пойти через SIR (детектирование "осколков" + время удерживания относ. стандарта), чувствительность выше чем MRM (по личному опыту по другим гликоз. белкам и инфе), но смущает более низкая специфичность (относ. MRM), я, правда, применяю одну хитрость, чтобы увеличить специфичность, но до уровня MRM все равно не тянет. Спасибо за вектор! Посмотрю. |
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
14.06.2010 // 14:22:40
Редактировано 1 раз(а) T.e. идея в том что дайджеста не делать и мод. пептиды не искать, а в LC/MS делать precursor scan на сахарные остатки из интактных белков, а потом считать интактные массы (белков) деконволюцией многозарядных ионов. Я правильно вас понял? Пусть коллеги поправят, но я бы так не делал, особенно in in vivo образцах. И особенно на трипл кваде, где чтобы быстро сканировать приходится ионную статистику просто потерять, но ведь еще и разрешения у машины совсем нет. Да еще белковые пики будут хвостить на LC, да еще аддукты на белках куда сильнее, чем на пептидах, ну и по мелочи типа окисленного метионина / -нов, да пара амидов дезамидировалась и т.д. - ну там еще много чего что никак не контролируется. Может лучше сделать дайджест (с трипсином? / LysC), посчитать ожидаемые пептиды, взять 2+/3+ зарядные прекерсоры (может, плюс еще одну форму с потерей воды?) и делaть MRM? Для контоля, можно поставить MRM на фрагмент m/z 86 задрав collision energy, по крайней мере будет реальный пик и будете уверены что это пептид, а не бэкграунд. |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
15.06.2010 // 12:05:08
Редактировано 1 раз(а)
Да, отчасти. Это был один из вариантов, который я хотел попробовать для данной ситуации (на пути к MRM), но конечная цель - MRM. Кстати, просмотрел программу ASMS 2010, и не нашел там постера (это точно постер был?) от Thermo с указанной тематикой (раздел, случайно не помните?).
C Вами согласен, что precursor scan не "фонтан" для данной ситуации. Если все правильно делать, то пики белков (конечно, мы понимаем, что многое еще зависит от белка) хвостить не будут. Да, аддукты сильнее.
Это я оставил на последок. Я знаю, что в основном делают так, хотя, в данной ситуации - это целая история. Просто, я решил попасть из пункта А в пункт В, минуя пункт С. |
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
15.06.2010 // 12:53:23
Сейчас статью выпихиваю, так что "хватай мешки вокзал отходит". Дайте мне день, мах 2 я этот постер раскопаю. Кстати, можeт коллеги из Thermo читают этот форум и могут помочь быстрее? Это точно постер, точно из Thermo откуда то из US,был вывешен Tue or Wed. Ни в коей мере не хочу вас отговаривать, но идея с интактными массами реально трудная - на рекомбинантных белках (особенно из компаний!) я видел много вариаций сиквенса и, соотв. интактной массы. Я имею ввиду что сиквенс из датабазы не в точности соответсвует сиквенсу белкового препарата: чтобы реальный сиквенс получить через патенты и т.д. нужно адское терпение иметь, плюс окисление метионинов (и меньше, н тоже не ноль, триптофана), плюс дезамидирование (и на низком разрешении масса просто с'езжает вверх), и т.д. Я бы начал со стандарта и пока я точно не увижу ясные массы в точности соответствующие ожидаемым, я в in vivo не полезу никогда. Там будет только хуже. Кстати, обычная ситуация в сервисе для кристаллографов. Приходят, сияющие - "отличные рентген, структура собралась ОК, пишем в Nature, массу вот подтвердите - кристалл вот он, количества для масс спека немерянные". Опс - а масса то вообще не та. Оказывается (регулярно!) плазмиду то никто и не секвенировал... чего возиться, надо мг грести и кристаллы лепить... |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
15.06.2010 // 17:07:06
Редактировано 2 раз(а)
Буду благодарен. Сам, вроде, все прокопал. Да и по сети смотрел, работы есть, конечно, но не от thermo.
Это как? Белок есть белок, если последовательность другая, то это... Или Вы имеете ввиду разницу условий - это ессно. Я то же начал со стандарта.
Да, остается только 
|
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
15.06.2010 // 18:01:15
Если это препарат, то сиквенс не обязательно совпадате с нативным белком (так как это в датабазе). Это может быть укороченный вариант, или вариант где несколько ак заменены - для технологичности или устойчивости, большего биол эффекта, чтобы обойти патент или вообще по неизвестным соображениям. Т.е сиквенс должен быть точно известен (изготовителям), где то отражен в документах / патентах, но не обязательно идентичен wild type. Какой же там реально сиквенс часто тяжело докопаться. Поэтому обязательно надо начать с точной массы, чтобы понимать с чем конкретно вы имеете дело |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
15.06.2010 // 19:04:23
Да... Не знал. Спасибо. Полезная инфа. Но к моей ситуации это не имеет отношения. |
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
16.06.2010 // 1:08:08
Коллекция pdf представленных Thermo на ASMS в Salt Lake City здесь: download свободный. Я имел в виду постер by Gvozdyak et al. "Srm Analysis Of Intact Biopolymers On Triple Quadrupole Instruments" Удачи! |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
16.06.2010 // 13:37:02
Спасибо! В общем, я так и собирался делать, и остановился на пункте 1 (full scan Q1) и задавал соотв. вопросы. Спасибо. Значит будем пробовать через предикт. З.Ы.: Thermo, MRM, proteins - поэтому ничего не нашел. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
