| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Определение жирных кислот в биоматериале >>>
|
 |
| Автор | Тема: Определение жирных кислот в биоматериале | ||
|
OYura Пользователь Ранг: 45 |
 14.01.2011 // 14:25:22
Работаю на ГХ Кристалл 2000М, капиллярная колонка НР 52 м. Определяю жирные кислоты в маслах. Необходимо провести анализ ЖК в мембранах клеток. Такого никогда не делал  .Как правильно провести экстракцию? Может у кого есть методики по этому поводу. Помогите пожалуйста. |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
14.01.2011 // 14:47:00
Смотрите в журналах биохимической направленности, типа Analytical Biochemistry и т.д. Вам нужно подходящий протокол "выделения" плазматических липидов найти, а дальше, как "обычно". Посмотрите еще здесь: Еще на molbiol.ru загляните. |
||
|
OYura Пользователь Ранг: 45 |
15.01.2011 // 18:10:24
Гексан:метанол 2:1 подойдет для экстракции липидной фракции? |
||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
17.01.2011 // 9:34:47
Да. Можно смесь хлороформ-метанол-вода в соотношении (2:1:0.8 v/v/v) ну и антиоксидант (напр. ионол) не помешает. |
||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
17.01.2011 // 21:20:49
Редактировано 3 раз(а) Если вы намереваетесь исследовать липиды мембран, а именно входящие в их состав жирные кислоты, то необходимо провести количественную двухстадийную экстракцию в токе аргона смесями хлороформ:метанол:вода и хролоформ:метанол:соляная кислота с 0,001% ионола в т.н. "аппарате Жукова" - даже для стеклодува средней руки его конструкция не составит особого труда [1]. Данный метод, при всей его трудоёмкости - экстракция занимает несколько часов - обеспечивает количественный выход липидов на уровне 99,73% (мой личный "рекорд") (экстрагируемость оценивали путём прямого омыления неэкстрагируемого остатка растительной ткани в экстракторе в присутствии маргариновой кислоты в качестве IS). Так как нам неизвестен ваш объект, то рекомендую полученный экстракт дополнительно "почистить" от триацилглицеринов и прочих неполярных липидных фракций с помощью ТСХ или на колонке на окиси алюминия - вы получите фракцию "полярных" липидов (стеринов, фосфоглицеринов и т.д.) [2] вот ее-то и подвергайте омылению с последующим метилированием свободных жирных кислот и ГЖХ, ГХ-МС анализам [3,4, 5] ) Так это выглядит в общих чертах, нужны подробности - с удовольствием поделюсь ) PS 1. Zhukov A.V., Vereshchagin A.G. Quantitative content of total polar lipids in soybean seeds // J. Amer, Oil Schem Soc. 1976. Vol. 53, p 1-7 2. Zhukov A.V., Vereshchagin A.G Current techniques of extraction, purification and preliminary fractionation of polar lipids of natural origin // Adv Lipid Res. 1981. Vol. 18. P. 247-282 3. Бережная, Г.А. Определение жирнокислотного состава и количественного содержания липидов в плодах облепихи / Г.А. Бережная, И.П. Елисеев, В.Д. Цыдендамбаев, А.Г. Верещагин // Прикл. биохимия и микробиология. – 1988. –Т. 24. – С. 568–573. 4. Пчелкин, В.П. Определение позиционно-видового состава запасных триацилглицеринов растений методом неполного химического деацилирования / В.П. Пчелкин, Э.И. Кузнецова, В.Д. Цыдендамбаев, А.Г. Верещагин // Физиология растений. – 2001. – Т. 48. – C. 809-816. 5. Tsydendambaev V.D., Christie W.W., Brechany E.Y., Vereshchagin A.G. Identification of Unusual Fatty Acids of Four Alpine Plant Species from the Pamirs //Phytochemistry. 2004. V.65, p. 2695-2703 |
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
18.01.2011 // 1:50:13
Редактировано 1 раз(а)
Вы хотите ЖК в мембранных липидах, или свободные ЖК в мембранах, если таковые найдутся? Если экстрагировать липиды, то классика: Bligh EG, Dyer WJ: A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 1959, 37:911-917. Folch JM, Lees, M., Sloane-Stanley, G. H.: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J Biol Chem 1957, 226:497-509. Эти две статьи типа "golden standard", но в наших руках Folch работает лучше. Довольно удачный "упрощенный" метод с MTBE: Matyash V, Liebisch G, Kurzchalia TV, Shevchenko A, Schwudke D: Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res 2008, 49:1137-1146. В принципе, экстрагируется все кроме гликолипидов, но эти надо делать в зависимости от того что а клетки. Ну и конечно PIP / PIP2 / PIP3 вообще делаются по другому, это вообще другой мир. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
18.01.2011 // 1:56:46
СЖК в мембранах - ошибка исследователя, но не природы ) не может их там быть... СЖК в растительной клетке вообще ОЧЕНЬ большая редкость.. чаще артефакт.. |
||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
18.01.2011 // 2:13:03
А, вот еще вспомнил, для ГЖХ анализа MEFA неплохо бы провести калибровку хроматографа с помощью готовых стандартов - смеси метиловых эфиров главных кислот с заведомо известной концентрацией и сравнить полученные данные с помощью ГЖХ путем интеграции пиков - так вы сможете вывести поправочные коэффициенты... Подробнее можно почитать у Cristie или у Пчелкина В.П. в работе "Распределение необычных жирных кислот в триацилглицеринах масла околоплодника облепихи" (Физиология растений, 2006, том. 53 №3) |
||
|
LVD Пользователь Ранг: 219 |
18.01.2011 // 8:40:23
to Chamomillablue По-видимому, Вы один из соавторов вышеуказанного ( с аппаратом Жукова) метода? Я думаю, что это один из возможных методов. И Кристи и блай и Дайер и современные группы исследователей в США, в Великобритании, наши во Владивостоке, обходятся без 2стадийной экстракции и выход липидов (у Владивостокцев, по крайней мере, то что я знаю) высокий 97-98%. Что касается свободных жирных кислот в растительной клетке, то они там появляются как в результате работы фосфолипазы А, активируемой кальцием, так и в результате ПОЛ. |
||
|
OYura Пользователь Ранг: 45 |
18.01.2011 // 13:10:29
Большое спасибо. Хроматограф откалиброван стандартной смесью метиловых эфиров. Калибровка, да и вся работа (с маслами) проводилась в растворах гексана (он первый вылетает с колонки и его пик не накладывается на пики метиловых эфиров). Пробоподготовка несложная: капля масла в 2 мл гексана, плюс 0,2 мл метилата натрия, на фильтр и готово. Анализ проводится методом внутренней нормализации: все пики 100% и соответственно по компонентах. Необходимо провести анализ жирнокислотного состава мембран эритроцитов (они уже выделены и заморожены). Еще предстоит пересылка (4 часа). Может пусть их сразу на месте проэкстрагируют смесью хлороформ: метанол:вода (какое соотношение?)? Дальше метелирование просто в этой системе и на хроматограф? Ионола у них нет пока, может какой-нибудь другой антиоксидант можно применить? Для начала хотелось бы попроще.  Подробности очень интересуют и фракционирование хотелось бы поставить в ближайшем будущем. |
||
|
Chamomillablue Пользователь Ранг: 1302 |
18.01.2011 // 18:09:55
Редактировано 2 раз(а) Нет, я не являюсь соавтором. Просто на первых этапах работы пользовался этим методом и он оказался очень удобным для количественной экстракции, когда необходимо проанализировать все классы липидов, особенно полярных. Сейчас мы от этого метода отказались, так как липиды мембран нас не интересуют и пользуемся сокращенной методикой экстракции абсолютным хлороформом в делительной воронке с водой. Водная фаза позволяет дополнительно отделить экстракт от углеводов и некоторых протеинов и прочих гидрофильных компонентов. Одной из причин, по которой пришлось перейти на "безметанольную" экстракцию стало то, что в нашем объекте, видимо, существуют ферменты, сохраняющие активность после замораживания ткани и ее фиксации в кипящей воде. Эти ферменты этерифицировали ЖК с образованием комплекса МЕ-эфиров даже при комнатной температуре и пониженной, за счет тока аргона, испаряющего из экстрактора хлороформ, и всего за 2-3 часа. Признаюсь, такую ферментативную активность мы наблюдали впервые.. P.S. сколько на своей памяти не анализировал растительные экстракты, СЖК не встречал. Были один раз, но это оказалось ошибкой пробоподготовки и длительного хранения экстракта в изопропаноле, в результате чего разрушились триацилглицерины и дали эти СЖК. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
