| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Водорастворимые витамины на ВЭЖХ Agilent 1200 >>>
|
 |
| Автор | Тема: Водорастворимые витамины на ВЭЖХ Agilent 1200 | |||||
|
FeroxDS Пользователь Ранг: 15 |
 08.08.2013 // 16:55:01
Доброго времени суток колеги. Задавал свой вопрос в одной из тем, но ответ так и не получил, поэтому решил завести отдельную тему, может хоть так, кто поможет. Итак я сам молекулярный биолог, и основной моей работой является анализ продуктов на содержание ГМО. Не так давно у нас сократился штат и меня отправили в лабораторию химического анализа осваивать ВЭЖХ. Сейчас основной задачей является определение водорастворимых витаминов В1, В2, В3, В5(пантотенат Са), В6 и фолиевой кислоты. Прочитав множества разных методик остановился на одной из них, вроде результаты получаю, но они какие-то не однозначные. Стандартные растворы дают нужные пики, стабильность и повторяемость присутствует, но когда прокалываю образцы пики во первых смещаются, а во вторых результаты сильно пляшут, как в меньшую так и в большую сторону. Очень хотел бы получить от вас помощи или совета. Ниже постараюсь описать методику, по которой я работаю. ВЭЖХ agilent 1200 с VWD и FLD детекторами, Колонка Zorbax SB-C18 4,6х150мм 3,5мкм Подвижная фаза А –ACN Пподвижная фаза В – Н2О Рh 3,0 доведенная H2SO4(по методике 2,0, но я побоялся испортить колонку поэтому ставлю 3,0) Стандартные растворы витаминов готовлю из расчета 50мг на 50мл. Так чтобы концентрация была 1мг на 1 мл. Для каждого витамина отдельно Рабочий стандартный раствор: 20мкл Стандартного раствора (каждого из шести витаминов) + 880мкл HCl 0,1М. Таким образом стандарт для прокола содержит по 20мкг каждого из витаминов. Характеристики вкола: Вкол 20мкл; поток 1,5 мл; градиент 0-3мин 2%А + 98%В, 3,5-10мин 20%А + 80%В (градиент подбирал эмпирически); длина волны VWD - В1, В3 - 244нм, В2, ФК - 262нм, В6-292нм, В5(пантотеновая к-та) 200нм. Делаю в среднем 5 проколов стандарта для насыщения колонки и пока выходящие пики не станут стабильными, после чего запускаю образцы для исследования. Вот тут и начинаются проблемы, методы для извлечения витаминов для разных групп продуктов разные (молочные, премиксы, бады и т.д.). Пытался делать и по Скурихину и по ГОСТам и по другим методикам и всегда результаты разные. Остановился на одной методике: 1г продукта + 10мл HCl 0,1М, все это гомогенизирую, растворяю (по мере возможности), помещаю в пробирку с прикручивающийся крышкой, и ставлю при 65С на твердотельный термостат 10мин. Затем на УЗ Баню 15 мин, после чего фильтрую, ц-фугирую при 8тыс обор/10мин., отбираю 200мкл фильтрата и довожу до 1мл 0,1М HCl . Собственно, это и вкалываю. При получении результатов с ВЭЖХ количество некоторых витаминов может на порядок быть больше чем заявлено в ТУ. Чувствую, что где-то допускаю ошибку, но не могу понять где. Подскажите! Заранее благодарю! С уважением. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
M@rgo Пользователь Ранг: 20 |
09.08.2013 // 20:16:21
Здравствуйте! Попробуйте по книжке MANUAL OF METHODS FOR DETERMINING MICRONUTRIENTS IN FORTIFIED FOODS, там все показано с картинками. Я бы Вам посоветовала все анализировать на одной волне, например 276,4; 450,8 и использовать внутренний стандарт, с витаминами не работала, однако я бы посоветовала Вам добавить в систему элюирования изопропанол, например начальная фаза 30% вода / 50% ацетонитрил / 20% изопропанол, затем за 14 минут до 30 % ацетонитрил / 70% изопропанол и так до 20 мин, затем к 20,1 мин исходный состав, промывка исходным минут 5 . Анализ: 8-10 раз раствор стандартов с ISTD, расчет факторов отклика аналитов к ISTD, затем по 2 раза проба, расчет концентраций по уже известным факторам отклика. |
|||||
|
FeroxDS Пользователь Ранг: 15 |
11.08.2013 // 21:26:58
M{coбaчkа}rgo Спасибо за ответ, и за книжку. Что касается самого анализа, то общей длины волны к сожалению, использовать не получается. Если витамины В1, В2, В3 и Фолиевую кислоту я как-то могу измерить на одной волне (262 нм), то вот витамин В6 и Пантотенат Са уже не получается, первый дает самый сильный пик на 292нм а второй на 200нм. К тому же витамин В6 и В3 у меня выходят в одно время и даже если подобрать единую волну, то они просто наложатся друг на друга. Что касается элюции, я не совсем Вас понял. Как я уже упоминал я молекулярный биолог, и для меня элюция это извлечение чего либо из пищевой матрицы. А Вы я так понял написали про сам процесс анализа? Ну тогда у меня многое не сходится. Сам анализ у меня идет 12 минут, а что касается подвижных фаз, то при добавлении на начальной стадии более 2% ACN, то у меня начинают сливаться пики В1 и В3. |
|||||
|
leshkin-yo Пользователь Ранг: 213 |
11.08.2013 // 22:32:57
Попробуйте определять витамины не в рамках одного анализа, а разбейте его на 2 но более простых. Если я правильно понял то Вам надо разработать методику определения этих витаминов? Если так, то сначала разберитесь с хроматографией (подберите условия при которых вещества хорошо делятся, нормальные тарелки, симметрия). А потом уже подготовку образца. По идеи если у вас одни и те же вещества в пробе и СО, то время удерживания не должно сильно отличаться. Если Вы только начали осваивать ВЭЖХ, то почитайте книги. Мне понравилась "Как избежать ошибок в ВЭЖХ" П. Саддек. |
|||||
|
FeroxDS Пользователь Ранг: 15 |
12.08.2013 // 10:33:36
Так в том то и дело, что он у меня уже разбит на 2 анализа. 1: В1,В3,ФК,В2 (по времени выхода). 2: В6 и Пантотенат Са. У меня сейчас 2 трудности. 1. Стандарты витаминов В1 и В3 выходят сразу друг за другом, даже если я буду определять их в разных анализах, то тут возникает другая проблема. В зависимости от пищевой матрицы эти витамины сдвигаются по времени в положительную или отрицательную стороны. А так, как в образце часто бывают оба этих витамина то понять на хроматограмме где из них какой становиться сложно. 2. Экстракция из пищевой матрицы. К нам приходят различные продукты для анализа, и если в премиксах или напитках экстракция идет хорошо, то вот в БАДах, молочных продуктах, мучных изделиях, фортифицированной муке или других продуктах добиться нормальной экстракции сложно. И одни и те же методы экстракции не работают. Вот с условиями разделения В1 и В3, как раз таки проблемы. Если я запускаю на чистой водяной фазе 100-98%, то разделение витаминов есть, но они граничат друг с другом. И небольшое отклонение в образце приводит к путанице ху из ху? При увеличении ACN более чем на 2% пики сливаются. Уменьшение потока сильно делу не помогает. Может можно заменить воду на что то, что лучше будет разделять эти два витамина? А вот на что? Пробовал делать по методике Шелеметьевой (водная фаза гептансульфонат натрия + дигидрофосфат калия), но добиться нужного разделения не удалось. Может быть Вы сможете, что нибудь посоветовать. И еще такой момент, в разных методиках время анализа витаминов разная от 15 до 45 минут, у меня же все мои витамины выходят в пределах 10 минут. За книгу спасибо, обязательно почитаю. |
|||||
|
chem4690 Пользователь Ранг: 132 |
12.08.2013 // 15:29:56
Идентификацию можно уточнить методом добавок - введите в полученный экстракт рассчитанное количество одного из витаминов и посмотрите, какой из пиков вырос. Может быть и такое, что пик не смещается, а просто в пробе посторонние вещества вместо Вашего, тогда на хроматограмме появится новый пик. Это, конечно, не решение проблемы, но способ прояснить обстановку. Вы уверены, что у Вас все в порядке с колонкой? Она новая? |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
FeroxDS Пользователь Ранг: 15 |
12.08.2013 // 17:30:38
Точно сказать не берусь, но где-то с полгода ей точно есть. Раньше на ней определяли витамины и консерванты с кофеином. Те кто работал до меня утверждают, что всё работает, однако я по их методикам и вовсе нормальных результатов не получаю, даже со стандартами. На мою просьбу приехать и показать, что, да как, постоянно придумывают предлоги не приезжать. Начал подозревать, что ребята вовсе не работали, а просто подделывали результаты. Что касается моих пиков, здесь можно глянуть Это стандарты, 20мкг/мл. Пантотеновая кислота детектируется на 200нм, все остальные на 262нм. Витамин В6 выходит в тоже время что и В3 только на другой волне 292нм. Вот собственно говоря растояние между В1 и В3 самое проблемное, так как именно здесь при смещении витаминов разобрать, кто есть кто, становится проблематичо. |
|||||
|
AA_Alex Пользователь Ранг: 372 |
14.08.2013 // 9:16:29
Редактировано 1 раз(а) Уважаемый ТС, анализ витаминов в сложных матрицах, особенно таких как БАДы и продукты, непростая задача, а тем более для начинающего, да еще если всего одна колонка  .Посмотрите, может что полезное найдете здесь: Проверьте Вашу колонку по колоночным стандартам (должен быть паспорт к колонке с тестовой хроматограммой). Купите еще колонок и разных. Вариант с ион-парной хроматографией (с гептилсульфонатом) должен нормально работать. Вы что-то не так намешали, какой у вас состав подвижной фазы? Как я понял, у Вас в сложных матрицах (продукты, БАДы) многократное завышение. Вы, надеюсь, уже поняли, что это у Вас одним пиком выходит кроме витамина что-то еще, что и дает завышение. Далеко не все колонки хорошо работают в ПФ с низким (1-3%) процентом ацетонитрила. Есть специально "заточенные" для этого колонки, типа Atlantis у Вотерса. По моему опыту очень хорошо с 0-3% работают колонки С18 Диасфер от БиоХимМака. У Вас есть флуориметрический детектор и Вы можете делать В1 и В2 на нем - достаточно специфичный метод и на порядок как минимум чувствительней, чем УФ. Пробоподготовка, особенно пищевых продуктов, это 90% всего дела. По витаминам в продуктах очень много статей и книг (лучше искать на английском, если нет проблем с языком), в том числе и про пробоподготовку. Универсальной методики на всё сразу не бывает. И пробоподготовку под каждый вид продукта надо адаптировать. Если есть крахмал, у вас при нагреве будет кисель. Тут может быть вариант с ферментированием (амилазой). И еще вопрос - у вас аналитическая лаборатория, значит вы должны работать по утвержденным методикам и НД? Или вы их сами должны разработать? |
|||||
|
FeroxDS Пользователь Ранг: 15 |
14.08.2013 // 16:18:06
2 AA_Alex Добрый день! Начну с последнего вопроса. Методики может и должны быть, но их нет. Ребята, что работали до меня, делали анализ по своим только им ведомым методикам. Пробоподготовка должна делаться на основе ГОСТов либо по Скурихину. По крайней мере они сидят у нас в аккредитации. Но делать пробоподготовку по ГОСТам я не могу, поскольку там необходим амилоризин, а его у нас днем с огнем… По Скурихину тоже не все получается, иногда результат нормальный, но чаще теряются те или иные витамины. Поэтому да, мне приходиться сейчас самому разрабатывать методику на витамины. Насчет сложности анализа, я уже успел оценить все прелести. Но у меня по большому счету нет выбора, кроме как разобраться в этом вопросе, к тому же интересно стало. Насчет колонки. Я не говорил, что она одна. Я просто указал ту, на которой сейчас работаю. Помимо нее есть еще несколько: Agilen ZORBAX Bonus-RP 4.6/150/5, Agilen ZORBAX Eclipse XDB C18 4.6/250/5, и еще одна колонка Waters (не атлантис), она старая (в смысле ей года 3), но она новая, из коробки. По гептансульфонату. 1г. гептансульфонат Na + 3.4г.калия фосфорнокислого однозамещенного на 1л воды. рН 3,0 доводил ортофосфорной кислотой. Относительно матриц и результатов. Результаты не всегда идут с завышением, часто бывает так, что отдельные витамины просто не выходят, либо их количество очень мало. Вообщем не соответствует НД. Хотя с другой стороны, как-то принесли на анализ премикс, немецкий. Точный состав сейчас не вспомню, не на работе, так вот результат анализа был почти идеален. Все пики вышли где надо, и количество соответствовало НД. Тоже касается и многих БАДов порошковых, жидких или таблетированых. Результаты там, более или менее бьются. Хотя опять-таки бывает так, что один витамин идет с сильным завышением, в то время как другой может идти с большими потерями. При этом остальные витамины могут быть в пределах допустимых отклонений. Но вот БАДы и препараты на основе масленистых составляющих, молочные продукты, хлебобулочные и макаронные изделия представляют самую большую сложность. То, что универсальных методик нет, я это тоже уже понял. Просто сейчас у меня есть главная головная боль, это два витамина выходящих друг за другом В1 и В2. В предыдущем посте я выкладывал ссылку на скрин. Мне почему-то кажется, что если я смогу их развести хотя бы на полминуты, то это уже будет хорошим подспорьем в работе. Буду рад любому совету. Спасибо за советы и ссылки! Обязательно прочту. |
|||||
|
AA_Alex Пользователь Ранг: 372 |
15.08.2013 // 9:13:00
Редактировано 3 раз(а)
|
|||||
|
FeroxDS Пользователь Ранг: 15 |
04.09.2013 // 10:32:12
Добрый день! Снова я со своими витаминами. Во первых, Спасибо большое за советы всем! Отдельное спасибо Алексу. Алекс, в общем поэкспериментировал я согласно Вашим советам и получил очень даже хорошие результаты. Но есть несколько новых вопросов. Во первых, я использую гептансульфонат Na, Вы же в своих постах пишете гептилсульфонат, одно ли это и тоже? Просто гептансульфонат Na достаточно дорогая вещь, у нас она стоит за 25г - 50000тг (10000 руб вашими), может гептилсульфонат дешевая замена? В моих исследованиях у меня результат стал стабильным при концентрации 300 мг/л., рН 3,0, колонку сейчас использую от Watersa, кстати я выше писал что у меня их колонка, ошибся колонка у меня Rigel, но её покупали для Watersa. Что то в гуле по запросу про эту колонку глухо. В общем с БАДами, таблетированными витаминами, витаминаминизированными напитками сейчас проблем уже нет, результаты всегда соответствуют. Метод удаления жира который Вы посоветовали очень помог мне. Однако вот недавно было у меня два проблемных продукта, 1. Детский Сироп (без спирта и жиров), вязкий продукт с большим содержанием сахаров. Там среди прочих витаминов больше всего было В3 - 23мг/100мл, так вот он у меня вообще не высветился, ни в каких разбавлениях. Вот в связи с этим очередной вопрос могут ли сахара связывать витамин В3 или все-таки сам продукт косячный? 2. сухое детское питание, если верить документам то витамины в нем представлены в виде добавленного премикса, то есть экстрагировать их из матрицы проблем быть не должно, однако опять таки результаты не соответствуют НД витамины В2 ФК меньше заявленного, а вот В1 и В3 зашкаливают. В чем может быть проблема? Амилоризин недавно заказали, когда придет пока не известно. Но есть текущие задачи, в частности то же детское питание или фортифицированные молочные продукты. Хочу спросить у знающих людей, можно ли как то провести экстракцию без амилоризина? Также хотел узнать, как вы осаждаете молоко? Я вот пробовал ТХУ и ТФУ, всё прекрасно осаждается, но у меня есть подозрение, что именно на этом этапе я теряю часть своих витаминов. И еще один может глупый вопрос, но все таки. Если скажем взять две одинаковые колонки и последовательно соединить их, можно ли таким образом получить лучшее разделение продуктов? Еще раз всем спасибо за советы! С уважением! |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 26
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
