| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Как произвести очистку рекомбинантного белка от ДНК продуцентов и как ее валидировать >>>
|
 |
| Автор | Тема: Как произвести очистку рекомбинантного белка от ДНК продуцентов и как ее валидировать |
|
Nitrogen Пользователь Ранг: 11 |
 10.07.2018 // 10:52:38
Редактировано 2 раз(а) Добрый день всем! Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O . Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100). Что лучше делать: 1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой. 2. Осадить полиэтиленимином :Polyethyleneimine_precipitation 3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE) Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет. при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку. 4. Может как-то использовать центрипреп? Как валидировать очистку? Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное. Буду благодарен за любую помощь. |
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|
Nitrogen Пользователь Ранг: 11 |
10.07.2018 // 15:30:41
Редактировано 1 раз(а) валидируют при помощи PCR, где то так: https:// Так же это изложено в USP, BP, EP. Есть порог чувствительности метода, но даже если ПЦР не обнаруживает копий вектора, они все равно там присутствуют в подпороговом количистве. Более того, при промышленной очистке от ДНК, целые молекулы ДНК попадают в конечную фракцию белка. Поэтому, они будут медленно, но уверенно забивать колонку, особенно если колонка минипреапаративная, годная для аналитики. Логично, что без предколонки работать нельзя. Или надо подбирать сорбент и буфер, чтобы высадить ДНК на самонабивной колонке на FPLC. У кого какие соображения по этому поводу? |
|
Nitrogen Пользователь Ранг: 11 |
11.07.2018 // 9:03:53
В принципе, белка-то для иммунизации мышей требуются микрограммы, но это должен быть очень чистый белок - без обрезанных форм и агрегатов и белков клетки - хозяина. Поэтому можно пользоваться аналитической или минипрепаративной колонкой. Ведь в промышленных масштабах животных не иммунизируют. В промышленных масштабах могут чистить анитилела из гибридом. Сначала на минипрепаративе, а затем - масштабирование на промышленные колонки. Наличие ДНК на иммунизацию мышей никак не влияет, это для человека рекомбинантные белки тестируют на наличие ДНК вектора или хозяина , во избежании потенциальных онкогенных эффектов. У мышек нужные иммунные клетки для получения гибридом появляются вне зависимости от наличия или отсутствия ДНК в рекомбинантном белке. Мышек не жалко 
|
| |
||
|
Ответов в этой теме: 2 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
