| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Билирубин и холестерин в желчных камнях >>>
|
 |
| Автор | Тема: Билирубин и холестерин в желчных камнях | |||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
 21.06.2006 // 15:24:43
Уважаемые форумчане ! Может у кого есть опыт анализа ВЭЖХ этих веществ в этих самых желчных камнях людей. Буду рад практическим приемам, если , конечно, кто-то захочет поделиться. Прикиды - то есть и наметки, но прежде чем приступить де факто к анализу этих конкрементов хотел бы услышать мнения практиков. Я не расписываюсь в беспомощности, но как повелось - одна голова - хорошо, а много голов  - намного лучше.Предыстория такова: Ко мне пришли от моего шефа его друг - биохимик и второй - хирург. Они, узнав, что у меня в отделе имеется ВЭЖХ, просят выполнить анализ столь необычных объектов на массовую долю холестерина и желчных пигментов с коньюгатами. Я подобными вещами никогда не имел дело. Вот и прошу советов, которые внимательно выслушаю. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
vesanna Пользователь Ранг: 70 |
 23.06.2006 // 10:17:13
Не знаю помогу или нет, но вот передо мною лежит книжка: "Почечные камни"(о различных патогенных минералов). Авторы - преподаватели моего ВУЗа Омского государственного университета им. Достоевского : В. Ф. Борбат и Голованова О. А.Исследуется структура, стороение, образование и минеральный состав камней. А еще - взяла почитать статью из журнала "Биохимия" Т.59, №2, 1994 г. "О возможности использования углеродных энтеросорбентов для нормализации холестеринового обмена(исследование адсорбции желчных кислот углями), методика определения - фотоспектрометрия. К сожалению, в известных мне статьях: Коллоидный журнал №6,2005,Журнал Физической химии №8,2005 - метод определения билирубина - спектрофотометрический. Точно не помню, но просматривая и биохимические методы определения этих веществ - хроматографию не встречала. Предется связаться с медицинскими справочниками или с форумом сайта molbiol.
|
|||||
|
Илья226 Пользователь Ранг: 354 |
 17.05.2007 // 12:09:42
Коллега Вы решили проблему? Не поделитесь методикой...а то ожидается нечто подобное в работе....заранее благодарен |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
17.05.2007 // 13:33:15
Редактировано 2 раз(а) Решил, но это по-бедности и простоте исполнения . Холестерин определял количественной ТСХ. Калибровал чистым холестерином. Билирубин и биливердин - ВЭЖХ по Хемаполовскому стандарту (он правда с белком из которого билирубин легко переходит в органику).Поскольку в количестве материала я был ограничен, то убивал двух зайцев сразу из одного раствора. Фрагменты камней раздавливал и затем малость растирал между двух кусочков алюминиевой фольги от ТСХ пластин. Брал навеску 5 мг и растворял в изопропаноле (1 мл). Если камни холестериновые (кремовые, белые, воскоподобные), то они растворяются без остатка. Изопропанольный раствор использовал для определения холестерина (1-2-4-5 мкл). А к проанализованому раствору добавлял 1 % водный раствор ТФУ в количестве 0,5 мл. При этом холестерин выпадал в осадок, который я отделял центрифугированием, а супернатант повергал ВЭЖХ. Методики ВЭЖХ при нормальном приборе (а не как у меня Милихром-4) найти не проблема в инете. Там тебе и коньюгаты и пигменты. Я же довольствовался свободным билирубином и биливердином, коньюгаты (суммарно) методом нормализации исходя из мысли о единой природе хромофоров. Привожу лишь условия для ТСХ холестерина. Повторюсь, метод выбран из бедности, но выполняется на раз . Можно, конечно холестерин и на газовом хроматографе сделать, но у меня нет ПИДа, а только ДПР. Анализ : Холестерин в желчных камнях 46-58 Дата : 09.08.2006 Оператор : Игорь Пластинка : 10 х 15 см 0,2 мм Сорбфил Объем нанесенного образца : 4 мкл Подвижная фаза : н-гексан : диэтиловый эфир:СН3СООН 35 : 15 : 1 Детекция : Визуальная. Проявитель : 10 % водный раствор фосфорномолибденовой кислоты Условия проявления: Пластинку окунают в проявитель , удаляют остатки проявителя и прогревают при 100°С в течение 5-10 минут. Если подробнее, то лучше общаться мейлом, а то не знаю толком как картинку поместить здесь. |
|||||
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
17.05.2007 // 13:45:34
Билирубин - это немного проще, хотя понятия не имею - сколько его там содержится.. Его лучше, мне кажется, делать в режиме гидрофильной хроматографии (для билирубина будет еще примесь ионного обмена): полярная аминофаза, допустим, элюент ацетонитрил-вода. Какое отношение нужно подсказать не могу, так как плохо помню его структурную формулу... опять же, лучше сначала делать пробоподготовку на сорбенте с ограничеснно доступной поверхностью или на хужший случай - ионообменном или смешанном.. Холестерин - проблемнее. Чем его видеть? Если его реально много, то увидеть его можно и на рефрактометре, но.. но.. куча "но". Может, знатоки подскажут как его дериватизовать, например, дансилом? (я не спец по дериватизации)? Самое лучшее, что приходит на ум - дериватизовать, и анализировать на нормальной фазе также с УФ детектированием.. |
|||||
|
Илья226 Пользователь Ранг: 354 |
17.05.2007 // 14:14:56
Редактировано 1 раз(а) Спасибо коллеги....а Вам не кажется что для билирубина и биливердина пробоподготовкой необходимо провести гидролиз? Он же насколько я понимаю в связанном виде в желчи находится...коньюгат? И еще вопрос- а обращенно фазная никак не пойдет? Типа пронтосила С-18? |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
17.05.2007 // 16:18:29
Редактировано 1 раз(а) Нужно и можно !!! , но моих заказчиков интересовала так сказать нативная среда, ско-ко свободного билирубина, ско-ко так сказать в виде коньюгатов. Если Вы когда-нибудь занимались биохимией крови, то там есть тест на билирубин диазореакцией. Так вот там определяют прямой (свободный) и связанный билирубин не прибегая к гидролизу. Т.е. имеет место быть какой-то части билирубина быть вне коньюгатов. Все зависит от задачи. Если Вас просто интересует просто количество билирубина, то наверное проще растворить камни и сделать обычный биохимический тест, но быстро !!!! раствор камней сначала зеленеет, а в некоторых случаях (камни черного цвета) становится иссиня-черным.А обращенка почему не подойдет, - подойдет ! Поройте инет и нароете, только в поисковике указывайте аглицкое название. Минимум 5-6 методик нароете. Я к сожалению сделал работу и забыл. Может дома припрятал, посмотрю. Должны были остаться и лит.обзор и протоколы анализов и отчет клиентам. |
|||||
|
Илья226 Пользователь Ранг: 354 |
18.05.2007 // 8:28:27
Спасибо Игорь....у меня задача пока стоит следующим образом- определение свободного и связанного билирубина в крови на ВЭЖХ....типа как альтернатива обычному биохимическому анализу. Просто обычные тесты для трупной крови результата не дали...то ли посмертные изменения протекают...то ли еще что....а хотелось бы использовать для судебно медицинской диагностики...в общем пока идея на стадии планирования....ну а холестерин тоже бы не мешало попутно так сказать.... |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
18.05.2007 // 13:20:27
Весьма странно, моя супруга определяет желчные пигменты в клинико-диагностической лаборатории даже у "собак", если приходят клиенты. А вот что может происходить с кровью у свежих трупов, т.е. чего там с билирубином ? Разве что начинается лизис эритроцитов то тогда , - да сделать сложно, потому что билирубин делают в сыворотке крови и главное, чтобы эта сыворотка не была "хилезной"(опалесциирующей, особенно после жирной пищи). |
|||||
|
Илья226 Пользователь Ранг: 354 |
18.05.2007 // 14:09:10
Редактировано 1 раз(а) Лизис скорее всего....трупная кровь она изначльно гемолизируется....свежей трупной крови коллега не бывает по определению.....уже у суточного трупа достаточно сложно добыть плазму. В реакциях происходит вот какая фигня...после пробоподготовки....осаждение, центрифугования...и проведения собственно диазо реакции четкой окраски не наблюдается...а образуется бурая каша....либо вообще ничего не образуется.....поковыряли мы рН среды...думали дело в нем...ни к чему это не привело .... В общем проблема интересная....в литературе для трупнеого материала наработок нет...а потребность-огромная..... А холестерин как считаете вообще на жидкостнике целесообразно крутить? Поглощения у него характерного нет....про дериватизацию я не говорю- в свое время на морфинах мучились с дериватизацией...выход очень низкий как правило...может чутья у методики не хватить......использовать ТСХ как Вы....тоже долгонько....поделитесь соображениями...я вижу Вы хроматографист опытный...был бы благодарен |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
21.05.2007 // 13:42:09
Конечно, лизированная кровь содержит гемоглобин в огромных количествах. А он также образует диазопроизводные, поскольку структурно содержит ГЕМ, который является предшественником билирубина. То бишь билирубин образуется из гемоглобина в конце-концов. Отсюда и "каша" , как Вы выразились, потому как гемоглобина значительно больше чем билирубина, да и реакция неспецифична. Если хотите определять билирубин, то скорее всего коньюгатов в такой крови Вы определить будет сложно, потому что сывороточные белки смешались с тем же гемоглобином из эритроцитов, а распознать без специфических стандартов, Ху из Ху будет весьма сложно, тем более, как я уже говорил коньюгаты иногда бывают весьма странного цвета имеющего мало общего с оранжево-красным. Но можно попробовать депротеинизировать гемолизированную кровь например ТХУ, приготовленой на этаноле. Отцентрифугировать, а потом анализировать декантант, который будет содержать свободный билирубин и ту часть коньюгатов, которые будут связаны с глюкуроновыми кислотами, а не с альбумином. Ну а с холестерином ВЭЖХ - бо-о-ольшая проблема из-за его "прозрачности" в УФ свете. Поэтому я бы поступил следующим образом: аликвоту крови проэкстрагировал бы хлороформом, хлороформенный экстракт упарил, а остаток нанес бы на ТСХ. Ну а далее дело техники. Достаточно просто. А чувствительность к холестерину ТСХ- примерно 0,5 мкг в точке нанесения. Можно и просто цветной реакцией, как это делают в клинико-диагностических лабораториях. Там тоже переэкстрагируют холестерин хлороформом, ну а затем добавляют серную кислоту, насколько я помню. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
