LANA100
Пользователь
Ранг: 12
|
 05.04.2012 // 12:26:11
N-Виталий пишет:
готовых методик к титратору у меня нет, руки пока не доходят но попробуйте почитать ниже может это вам поможет!
Необходимость валидации аналитических методик
Для того чтобы аналитическая методика заняла достойное место в системе обеспечения качества, соответствовала своему назначению, то есть гарантировала достоверные и точные результаты анализа, предусмотрена процедура валидации аналитических методик. Необходимость валидации всех аналитических методик не вызывает сомнений — это один из элементов валидации всего процесса производства лекарств. Кроме этого, с практической точки зрения, валидация аналитических методик дает ряд существенных «вторичных» полезных эффектов.
Во-первых, при проведении валидации в процессе разработки новых методик можно своевременно выявить их недостатки и на ранних стадиях существенно улучшить методику. Во-вторых, при грамотно и качественно выполненной работе появляется уверенность и в методике, и в качестве анализируемого препарата. В третьих, в процессе валидации обязательно принимают практическое участие различные аналитические лаборатории. Практика валидационных экспериментов дает понимание сути методики и осознание необходимости строгого соблюдения ее параметров. В результате, при последующей эксплуатации валидированной методики значительно снижается вероятность ошибок.
Начальный практический опыт валидации аналитической методики мы приобрели в 1998 г. при освоении нового препарата. При этом валидация для нас была не целью, а средством: необходимо было изменить методику количественного определения препарата. При этом нужна была уверенность в том, что новая методика работает хорошо и не создаст нам проблем в дальнейшем. Для этого было решено провести валидацию методики и заодно испытать на практике, насколько это реально в условиях рядового российского фармацевтического предприятия. Следует отметить, что метрологические испытания вновь разрабатываемых методик по ряду параметров (линейность, сходимость результатов и пр.) проводились нами и ранее.
Первая проблема, с которой мы столкнулись — недостаток литературы по данному вопросу. Источник, на который мы опирались, — фармакопея США 23 издания (USP 23) [1]. Был разработан достаточно подробный план, определено необходимое количество экспериментов (более 600 анализов), разработаны критерии для оценки параметров валидации. Практические работы по валидации методики проводились в двух аналитических лабораториях с использованием разных приборов. Все работы, включая составление плана, обработку результатов и составление отчета, заняли около месяца.
Вновь к валидации аналитических методик мы вернулись в 2000 г. и уже с более глубоким пониманием процесса валидации. Прежде всего, была разработана и утверждена документация по процедуре валидации методик с подробным описанием процесса подготовки, проведения валидации, критериев. За основу по-прежнему брали статью Validation of Compendial Methods USP 23, критерии разрабатывали самостоятельно, исходя из практического опыта и разумных соображений.
Более 3 лет большая группа специалистов нашего предприятия систематически занимается валидацией аналитических методик различных типов и предназначений. За это время нами проведена валидация более 50 аналитических методик различных типов: ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ, спектрофотометрические, титриметрические, методики количественного определения, определения растворения и однородности дозирования, примесей, остаточного загрязнения поверхности оборудования после очистки и пр. Отработан механизм процесса валидации, переработана документация, уточнены критерии параметров. Мы также изучали специальную литературу по данному вопросу и с удовольствием отметили, что разработанные нами подходы и критерии оказались достаточно близкими, во многом практически совпадали с подходами и критериями, рекомендуемыми зарубежными авторами [2]].
Нормативные документы по валидации методик
Мировая история GMP насчитывает уже почти 40 лет. Международная документальная база по валидации методик хорошо развита. В первую очередь это нормативные документы — уже упомянутая статья фармакопеи США «Validation of Compendial Methods» [1, 3], документы Международной Конференции по Гармонизации (ICH) [4, 5]. Они содержат, во-первых, четкое определение цели валидации методик, объект применения процедуры: «…методы испытаний, используемые для оценки соответствия фармацевтических продуктов определенным техническим требованиям (спецификациям)…». Определяется круг методик, которые необходимо валидировать (новые, или измененные, представляемые на утверждение), и какая дополнительная информация должна представляться совместно с методикой при ее утверждении.
Далее в нормативных документах определяется процедура валидации, и расшифровываются аналитические параметры, по которым производится валидация методик. Для каждого аналитического параметра приводится как минимум один способ определения, оговариваются условия (минимальное количество экспериментов, способ расчета, выражения числового показателя того или иного параметра). При этом не устанавливаются критерии допустимых значений параметров (принцип разумно обоснованного подхода).
Документы ICH, кроме вышеперечисленного, содержат подходы к методологии процесса валидации методик. Для практики валидации аналитических методик все же недостаточно только описания параметров, методологии их определений, способов выражения (то, что дают фармакопейные документы). Необходима также информация о том, как организовать процесс, оптимизировать исследования и выбирать числовые критерии, на каком этапе разработки методики проводить валидацию и т.д. В этом существенную помощь оказывают дополнительные официальные документы [5, 6, 7] и публикации различных авторов и организаций [2, 8, 9, 10, 11]. К сожалению, все перечисленные публикации зарубежные. В отечественной печати появляются статьи, касающиеся вопроса валидации методик [12, 13], но они имеют общий характер, содержат в основном постулаты GMP и общие определения. Материалов по методологии валидации методик в отечественной печати мы, к сожалению, пока не встречали.
Совершенно очевидно, что для распространения практики валидации аналитических методик необходима соответствующая национальная документация и, прежде всего, ОФС, проект которой недавно был опубликован [14]. Опубликованный проект ОФС в целом очень близок к аналогичным документам ICH и USP.
Валидационные параметры
Во всех нормативных документах по валидации аналитических методик [1, 3, 4, 5, 14] методологическая часть начинается с определения параметров валидации. При этом применяется специальная терминология, причем в различных документах (особенно в переводах) зачастую одни и те же термины используются в разных значениях. Для того чтобы избежать этого, в данной статье в вопросах терминологии мы будем опираться на рекомендации ICH [4] и USP [3]].
Для валидации методик используются следующие параметры:
правильность (accuracy) — близость получаемых результатов к истинному значению, оценивается по погрешности определения;
специфичность (specificity) — способность измерять точно и селективно аналит (определяемое вещество) в присутствии компонентов, которые могут ожидаться в матрице образца (примеси, родственные химические соединения, продукты разложения, ингредиенты плацебо), также оценивается по погрешности определения;
точность (precision) — мера сходимости результатов при многократном повторении аналитической процедуры.
Точность методики определяется двумя параметрами: сходимость и воспроизводимость:
сходимость (repeatability) — близость результатов индивидуальных тесто в, когда процедура анализа повторяется на многочисленных пробах гомогенного образца одинаковых проб в нормальных условиях проведения анализа (иногда переводится как повторяемость), критерием является стандартное отклонение параллельных определений;
воспроизводимость (reproducibility) — степень сходимости результатов, полученных анализом одних и тех же образцов при различных нормальных условиях теста - разные лаборатории, химики-аналитики, инструменты, партии реактивов, температура окружающей среды, различное время проведения анализов и т.п., также оценивается по стандартному отклонению параллельных определений;
линейность (linearity) — способность показать, что результаты теста сразу или после определенной математической обработки пропорциональны концентрации аналита в образце в пределах данного интервала, определяется математической обработкой результатов теста образцов с различными концентрациями аналита в пределах интервала, установленного для данного метода. Обычно производится расчет линии регрессии методом наименьших квадратов для результатов с различными концентрациями аналита. Наклон регрессионной линии и его вариация дает математическую степень линейности. Для оценки степени линейности должны быть рассчитаны коэффициент корреляции, перекрывание оси Y, наклон регрессионной линии и остаточная сумма отклонений;
интервал метода (range) оценивается проверкой того, как данный аналитический метод обеспечивает точность, правильность и линейность при определении образцов, содержащих аналит на границах интервала и внутри его. Определяется в ходе проведения испытаний по каждому из перечисленных параметров;
обнаружения (limit of detection) — параметр предельных тестов — минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не определена количественно в условиях анализа. Определение предела обнаружения варьируется в зависимости от типа метода (инструментальный или неинструментальный). Для инструментальных методов в основном определяют отношение сигнал/шум или измеряют величину фонового сигнала, после чего рассчитывают минимальный уровень (обычно принимают отношение сигнал/шум = 2:1 или 3:1).. Этот предел потом оценивается анализом ряда образцов с содержанием аналита близким к пределу (реальных или специально приготовленных). Для неинструментальных методов предел обнаружения определяется анализом образцов с известными концентрациями аналита и установлением минимального уровня аналита, при котором он может быть достоверно обнаружен;
количественного определения (limit of quantitation) — параметр количественного определения для низших уровней содержания веществ в пробе образцов, таких как примеси или продукты разложения. Это минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть определена с приемлемой точностью в условиях анализа. Выражается концентрацией аналита в образце. Определение, так же как и в случае предела обнаружения, различается для инструментальных и неинструментальных методов. Процедура аналогична, обычно используют значение фактора, равное 10;;
устойчивость (robustness) — мера способности не подвергаться воздействию небольших, но запредельных отклонений параметров методики — показывает точность и правильность в нормальных условиях. Определяется проведением теста правильности при небольших отклонениях параметров методики или свойств анализируемого объекта. Рассчитывается погрешность по сравнению с результатами, полученными в нормальных условиях. Если наблюдается влияние параметров методики, это оговаривается в тексте методики.
Рекомендации по определению параметров
Следует подробнее остановиться на рекомендациях по определению различных параметров и примерах минимальных критериев для этих параметров. Мы приводим здесь краткий обзор этой информации в той последовательности параметров, которая обычно принимается авторами.
Специфичность/селективность
Термины «селективность» и «специфичность» часто используются взаимозаменяемо [10]. Имеются разногласия между определением специфичности IUPAC/WELAC и ICH. IUPAC (Международный союз фундаментальной и прикладной химии) и WELAC (Западноевропейская лабораторная конференция аккредитации) относят термин «специфичный» (specific) к методу, который обеспечивает сигнал (отклик) только для одного аналита, в то время как термин «избирательный» (selective) относится к методу, который обеспечивает отклики для ряда химических объектов. Так как существует мало методов, которые определяют только один аналит, термин «селективность» обычно более предпочтителен. Тем не менее в документах ICH, USP [3, 4] и проекте российской ОФС по валидации методик [14] употребляется термин «специфичность», а не «селективность», и в дальнейшем мы также будем использовать «фармакопейную» терминологию.
Нормативные документы определяют специфичность аналитического метода как его способность измерить точно аналит в присутствии мешающих веществ, которые могут ожидаться в матрице образца.
Для хроматографических методов, например, рекомендуется сравнивать параметры пика аналита в модельных смесях, содержащих все возможные примесные соединения и компоненты плацебо, с аналогичными параметрами образца чистого аналита. После анализа таких смесей проводится оценка чистоты пика аналита и разрешения с ближайшим пиком. Пример критерия специфичности для хроматографических методов — разрешение не менее 1,5 с любым соседним пиком. Если этого невозможно достичь, необходимо показать, что неразрешенные компоненты на максимальном ожидаемом уровне не повлияют на результат количественного определения аналита более чем на 0,5% [2]].
Точность, сходимость и воспроизводимость
Точность метода обычно определяется как степень согласованности результатов множественных анализов одного образца. Измеренное среднеквадратичное отклонение для параллельных анализов подразделяют на три категории: сходимость (повторяемость), промежуточная точность и воспроизводимость [2, 5, 8]. Сходимость получают, когда анализ выполнен в одной лаборатории одним оператором на одном оборудовании за относительно короткий промежуток времени (в проекте ОФС [14] это называют почему-то воспроизводимостью). По крайней мере должно быть проведено 5 или 6 определений для трех различных матриц при двух или трех различных концентрациях и рассчитано относительное среднеквадратичное отклонение [8]].
Другие авторы предлагают вначале испытать инструментальную воспроизводимость, затем определяется внутрилабораторная воспроизводимость — повторяющийся анализ в одной лаборатории в один день аликвоты однородной пробы с полным повторением процедуры приготовления пробы и выполнения измерений. Авторы оставляют на усмотрение исполнителей определение необходимого количества повторных приготовлений проб и повторных измерений для каждой пробы [2]].
Критерий приемки для повторяемости существенно зависит от типа анализа. Для объектов сложного состава точность зависит от матрицы, концентрации аналита и методики анализа. Стандартное отклонение (sr) может изменяться между 2% и 20%. Приводятся значения критериев инструментальной воспроизводимости sr = 1%, внутрилабораторной воспроизводимости sr = 2% для количественного определения основного компонента, для примесей на пределе определения — 5% и 10% соответственно [2]. AOAC приводит данные оценки сходимости как функции концентрации аналита (см. таблицу) [8]].
Промежуточная точность определяется сравнением результатов выполнения метода в пределах одной лаборатории в течение нескольких недель. Она отражает несоответствия в результатах, полученных различными операторами, от различных приборов, с различными стандартами и реактивами, с колонками различных партий или их комбинациями [8]].
Воспроизводимость представляет точность, полученную между лабораториями [4, 5]. Цель состоит в том, чтобы проверить, обеспечит ли метод те же самые результаты в различных лабораториях. Валидация воспроизводимости важна, если метод будет использоваться в различных лабораториях. Типичные переменные, влияющие на воспроизводимость метода [8]]:
— различия в температуре и влажности окружающей среды;
— различные опыт и аккуратность операторов;
— различия в характеристиках оборудования и расходных материалов;
— различные качество и срок годности реактивов и других материалов.
Таблица
Зависимость повторяемости и извлечения от концентрации аналита [8, 10]]
Уровень концентрации аналита Сходимость (sr, %) Среднее извлечение (%)
1 1,33 998–1102
10–1 22,88 998–1102
10–2 22,77 997–1103
10–3 33,77 995–1105
10–4 55,33 990–1107
10–5 77,33 880–1110
10–6 111 880–1110
10–7 115 880–1110
10–8 221 660–1115
10–9 330 440–1120
Правильность и извлечение
Правильность аналитического метода — степень, с которой соглашаются (сходятся) результаты испытаний и истинные значения. Истинное значение для оценки правильности может быть получено несколькими путями. Во-первых, можно сравнить результаты метода с результатами валидированного эталонного метода (обычно редко применяется). Во-вторых, правильность может быть оценена анализом модельных образцов с известными концентрациями, приготовленными полностью из стандартных веществ или методом добавок [3, 4, 5, 8]. Возможность альтернативы здесь очень важна, например, в проекте российской ОФС [14] определение правильности методик анализа примесей предусмотрено только методом добавок, что резко ограничивает возможности экспериментатора.
После экстракции аналита из матрицы, его концентрация в извлечении обычно определяется сравнением сигнала экстракта с сигналом сравнительного материала, растворенного в чистом растворителе. Поскольку при этом оценка правильности измеряет также и эффективность подготовки пробы (извлечения), при проведении испытаний необходимо смоделировать фактическую подготовку пробы настолько близко насколько это возможно. Показано [10], что ожидаемое извлечение зависит от матрицы образца, процедуры обработки образца и от концентрации аналита. Как пример приводятся следующие значения допустимой относительной погрешности при определении правильности методов [2]: для количественного определения — +2% в диапазоне 80ё100% номинальной концентрации аналита, для примесей с нормируемым содержанием — 0,1ё2,55% — до +10%%.
Линейность и калибровочная кривая
Линейность аналитического метода — показатель того, что результаты испытаний являются непосредственно или посредством четких математических преобразований пропорциональными концентрации аналита в образцах в пределах данного диапазона [3, 4]. Согласно большинству источников линейность определяется повторением от трех до шести инъекций пяти или большего количества стандартов, концентрации которых перекрывают 80ё120% от ожидаемого концентрационного диапазона (некоторые авторы предлагают диапазон 50ё150%) [2, 3, 4, 5, 8]].
Для оценки линейности метода применяют ряд критериев. Во-первых, отклик должен быть пропорционален концентрации аналита. При этом рассчитывается уравнение регрессии и дополнительные статистические показатели. Уравнение линейной регрессии, примененное к результатам, должно иметь отрезок, отсекаемый на координатной оси, близкий к нулю. В противном случае должно быть доказано, что это не влияет на правильность метода.
Коэффициент корреляции линейной регрессии должен быть близок к 1 (более 0,999 обычно считается приемлемым для установления линейности метода [8]]).
Часто линейность оценивается графически в добавление к математической оценке или как альтернатива ей. Поскольку отклонения от линейности иногда трудно обнаружить, могут использоваться две дополнительные графические процедуры. Первый график должен изобразить взаимосвязь отклонения от линии регрессии и концентрации. Для линейных интервалов отклонения должны быть одинаково распределены между положительными и отрицательными значениями. Другой подход — построение зависимости относительных откликов от концентрации. Полученная линия должна быть горизонтальна по полному линейному диапазону (отклонение от горизонтальной линии не более чем на 5%) [8]].
Другие авторы устанавливают следующие значения допустимых критериев для различных методов [2]]:
— для количественного определения коэффициент корреляции — не менее 0,99, пересечение с осью Y — не более 2% отклика номинальной концентрации, относительный отклик во всем диапазоне не отличается от относительного отклика при номинальной концентрации более чем на 2,5%%;;
— для определения примесей соответствующие числовые критерии — коэффициент корреляции 0,98, пересечение с осью Y — не более 10% отклика концентрации примеси 2,5%,, разброс относительного отклика — не более 5%%.
Диапазон
Диапазон аналитического метода — интервал между верхними и нижними уровнями (включая эти уровни), для которых продемонстрировано, что они определяются с правильностью, точностью и линейностью, при использовании метода, как предписано. Диапазон обычно выражается в тех же самых единицах, что и результаты испытаний, полученные аналитическим методом (например, процент, доли на миллион). Пример критериев для установления диапазона: линейность и правильность соответствуют общим критериям для данных параметров, воспроизводимость для определения основного компонента не превышает 3%, для определения примесей — не выше 10% [2]].
Предел обнаружения и определения
Предел обнаружения — точка, в которой измеренная величина больше, чем неопределенность, связанная с ней [8]. Это самая низкая концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не обязательно определена количественно. В хроматографии предел чувствительности — введенное количество, которое дает пик с высотой, по крайней мере, вдвое или втрое выше базового уровня шума.
Предел определения — минимальное введенное количество, которое обеспечивает точные измерения (обычно от 10 до 20 раз выше, чем базовый шум). Если была определена требуемая сходимость метода в пределе определения, может использоваться подход EURACHEM [16]. Ряд образцов с уменьшающимся количеством аналита анализируют и строят график зависимости относительного стандартного отклонения сходимости от количества аналита. Количество, которое соответствует предварительно определенной требуемой сходимости, равно пределу определения. Другой подход — установление предела определения по внутрилабораторной воспроизводимости (рекомендуется sr = 20%) [2]].
В то же время, согласно фармакопейной документации [1, 3, 4], установленный предел обнаружения и определения должен быть подтвержден анализом модельных смесей, содержащих аналит на пределе и близко к нему (очевидно, критерий «правильность»). В проекте ОФС [14] предполагается определять пределы методики по калибровочной кривой, что, на наш взгляд, не совсем корректно, т.к. при калибровке не учитывается влияние плацебо. Также ничего не говорится о проверке установленных пределов на модельных смесях.
Устойчивость (надежность, прочность)
В испытаниях прочности исследуют влияние операционных параметров на результаты анализа. Для определения прочности метода ряд хроматографических параметров (например, скорость потока, температура колонки, объем ввода пробы, длина волны детектирования или состав подвижной фазы) изменяют в пределах реального диапазона и определяют количественное влияние этих переменных. Такие данные позволяют решить, должен ли метод быть ревалидирован, когда один или большее количество параметров изменены (например, для компенсации изменения колонки во времени) [2, 8]. В документах ICH рекомендуется проводить оценку прочности методов в фазе разработки, но не требуется включать как часть регистрационного приложения [4, 5]. В проекте ОФС [14] этот показатель опущен.
Рекомендации по организации процесса валидации методики
На наш взгляд, очень интересны рекомендации по организации процесса валидации методики в целом [8]. Авторы подробно описывают этапы процесса и дают практические советы:
1. Разработать протокол валидации или рабочий процесс для валидации, в котором определить приложение, цель и область метода, эксплуатационные параметры и критерий приемки, валидационные эксперименты;
2. Определить необходимые рабочие характеристики оборудования, квалифицировать материалы, например, стандарты и реактивы;
3. Исполнить эксперименты предвалидации, корректировать параметры метода или критерии приемки в случае необходимости;
4. Исполнить полные внутренние и внешние эксперименты валидации;
5. Разработать СОП (стандартную операционную процедуру) для рутинного выполнения метода, определить критерии для ревалидации;
6. Определить тип и частоту испытаний пригодности метода;
7. Документировать эксперименты и результаты валидации в отчете.
Протокол (план) валидации рекомендуется оформлять в форме подробной пошаговой инструкции [8]. На первом этапе определяется область метода и критерии его валидации. Рабочие характеристики метода следует выбирать с учетом предназначения методики [2, 8]. Если нет или недостаточно информации относительно рабочих характеристик методики, рекомендуется доказать пригодность в начальных экспериментах. Таким образом, развитие метода и валидация — итеративный процесс [2]].
В официальной литературе нет рекомендаций по последовательности экспериментов валидации, и оптимальная последовательность может зависеть от метода непосредственно. Как один из вариантов может быть признана полезной следующая последовательность [9]]:
1. Селективность стандартов (оптимизация разделения и детектирования на стандартных смесях);
2. Точность (сходимость, воспроизводимость);
3. Линейность, предел определения, предел обнаружения, диапазон;
4. Селективность с реальными образцами;
5. Правильность на различных концентрациях;
6. Прочность (межлабораторные изучения).
Другой вариант [2] предполагает следующую последовательность операций подготовки и выполнения валидационных исследований:
1. Постановка минимума требований для приемки метода (здесь же необходимо определить область применения методики, разработать план валидации с пошаговым планированием валидационных экспериментов);
2. Определение специфичности (селективности) метода;
3. Исследование линейности;
4. Установление правильности метода;
5. Определение диапазона метода;
6. Изучение воспроизводимости (Этап I, инструментальная и внутрилабораторная воспроизводимость);
7. Установление предела обнаружения и предела количественного определения (для методик определения примесей);
8. Изучение стабильности методики;
9. Исследование воспроизводимости (Этап II, промежуточная и межлабораторная воспроизводимость);
10. Изучение устойчивости метода.
В отчет о валидации методики обычно рекомендуется включать следующее [8]]:
— цель и контекст метода (область применения, процедура);
— тип анализируемых веществ и матрицы;
— детальную информацию о реактивах, эталонах и приготовлении контрольных (стандартных) образцов;
— процедуры для проверок качества стандартов и используемых реактивов;
— соображения безопасности;
— параметры метода;
— критические параметры, установленные при испытании прочности;
— перечень оборудования и его функциональных и эксплуатационных характеристик, например (для хроматографии), размеры ячейки, шум базовой линии, диапазон температур колонки;
— детальные условия проведения экспериментов, включая подготовку пробы;
— процедуры вычислений и статистической обработки результатов;
— процедуры для контроля качества в процессе эксплуатации методики (например, испытания пригодности системы);
— графическую информацию, например хроматограммы, спектры и калибровочные кривые;
— пределы эксплуатационных данных для принятия метода;
— ожидаемую неопределенность результатов измерения;
— критерии для ревалидации;
— специалистов, которые разрабатывали и первоначально валидировали метод;
— резюме и заключения.
|
05.04.2012 // 12:34:52
[]
