1.3 Элюент, как составляющая хроматографической системы

Для успешного осуществления хроматографического разделения, в первую очередь важно обеспечить умеренное взаимодействие разделяемых веществ с сорбентом, поскольку, как уже говорилось, при отсутствии такого взаимодействия разделение не происходит, а при слишком сильном взаимодействии происходит прочная сорбция компонентов пробы на сорбенте. Они, либо вообще не выходят из колонки, либо выходят неприемлемо долго, и цель хроматографического эксперимента также не достигается.

Если в распоряжении хроматографиста уже есть колонка, заполненная определенным типом сорбента, единственным средством регулирования удерживания компонентов пробы является состав элюента. В качестве элюента могут выступать органические растворители, их смеси, водные растворы органических и неорганических веществ. Каждый растворитель обладает по отношению к конкретному типу сорбента определенной элюирующей силой, под которой понимают способность данного растворителя вымывать (десорбировать) с данного сорбента разделяемые вещества.

Для каждой хроматографической системы растворители по возрастанию или убыванию элюирующей силы можно расположить в элюотропный ряд.

Казалось бы, учитывая то многообразие органических и неорганических веществ, которые можно было бы использовать в качестве растворителей, всегда можно подобрать некое вещество, обладающее в данной хроматографической системе подходящей элюирующей силой.

Тем не менее, в практике хроматографии использование элюентов, состоящих из одного вещества - явление крайне редкое. Этому есть несколько причин.

Во-первых, некоторые вещества сложно использовать в качестве растворителей ввиду их высокой стоимости, токсичности, химической нестойкости или агрессивного воздействия на элементы хроматографической аппаратуры.

Во-вторых, препятствием к использованию в качестве компонентов элюента некоторых растворителей является совокупность их физических свойств, например, высокая вязкость, обуславливающая применение неприемлемо высокого давления на входе в колонку для создания оптимальной скорости протока элюента через слой сорбента. Целый ряд ограничений для использования растворителей в колоночной ЖХ накладывают и способы детектирования веществ, выходящих из колонки, которые также будут рассмотрены далее.

Таким образом, круг применимых в практике колоночной ЖХ растворителей сужается примерно до двух - трех десятков.

И, наконец, может так оказаться, что требуемая элюирующая сила находится в промежутке между силами двух рядом расположенных в элюотропном ряду растворителей.

Именно из-за совокупности этих причин в качестве основы элюента чаще всего используют смесь двух растворителей – с заведомо более слабой (растворитель А) и с заведомо более сильной (растворитель В) элюирующей силой, чем это необходимо для данного хроматографического разделения.

Компонент А обеспечивает преимущественно транспортную функцию для перемещения в колонке уже десорбированного вещества, компонент В, напротив, являясь конкурентом разделяемых веществ в сорбционных процессах, может их вытеснять с сорбента в объем элюента и, тем самым, значительно уменьшать их время удерживания. Увеличивая долю компонента В в растворителе А, можно плавно менять элюирующую силу этой смеси и добиться практически любой ее величины в промежутке элюотропного ряда от А до В.

Сразу же следует оговориться, что один и тот же растворитель, в зависимости от типа применяемого сорбента, может быть как сильным элюентом, так и слабым. Кроме того, смеси разных растворителей при одинаковой элюирующей силе могут обладать различным воздействием на селективность разделения данной пары веществ. По этой причине иногда часть одного сильного компонента заменяют на другой, также сильный компонент, но с другой селективностью, и элюент получается уже трехкомпонентным. Однако на практике необходимость в этом возникает достаточно редко.

Справочные данные по физико-химическим свойствам растворителей для ЖХ, а также основные концепции использования их смесей в качестве элюентов в ВЭЖХ просто исчерпывающе представлены в [9-11].

Зависимость фактора удерживания от концентрации сильного компонента в элюенте обычно имеет вид гиперболы (рис. 1.8). Для линеаризации этой зависимости (получения графика в виде прямой линии) график строят в других координатах. В зависимости от реализуемого механизма сорбции и вида кривой, чаще всего используют координаты 1/ k´ - С; lg k´ - C и lg k´ - lg C [2].

Рис. 1.8. Типичный вид зависимости фактора удерживания
от концентрации компонента В в элюенте.

До сих пор рассматривалось применение элюента одного состава для проведения всего хроматографического эксперимента. Такой режим в хроматографии  называется изократическим элюированием (в сленговом  варианте – изократом). Однако не всегда задачу качественного разделения смеси удается решить в этом режиме.

Как уже говорилось, на хроматограмме в идеале одному пику соответствует один компонент пробы. Если разделяемая смесь содержит всего 2-3 вещества, то, варьируя состав элюента, добиться этого - не составляет большого труда.

На практике, особенно при аналитическом приложении хроматографии, часто приходится иметь дело с гораздо более сложными смесями, состоящими из десятков, а порой - из  сотен различных веществ. Задача существенно облегчается, когда для анализа целевыми являются лишь несколько веществ из такой смеси. В этом случае стоит задача отделения совокупности всех прочих веществ пробы, кроме анализируемых, называемых матрицей и, при организации хроматографического эксперимента, стараются добиться хорошего разделения целевых веществ, как от матрицы, так и друг от друга. Чаще всего стараются, чтобы компоненты матрицы элюировались неразделенными, в виде одного пика в начале хроматограммы со временем удерживания, близким к t₀, а анализируемые вещества вышли бы отдельными пиками на чистой от посторонних веществ области хроматограммы. Зачастую и такая задача решаема в изократическом режиме.

Рис. 1.9. Вид хроматограммы при изократическом и градиентном элюировании.

Все обстоит куда как сложнее, если необходимо разделение всех компонентов смеси, состоящей из нескольких веществ, удерживание которых в используемой хроматографической системе сильно отличается. В этом случае, применив достаточно слабый элюент, можно добиться хорошего разделения наиболее слабо удерживаемых компонентов пробы, а более прочно сорбированные вещества будут выходить из колонки слишком поздно в виде сильно размытых пиков или вообще останутся в колонке. Если же применить более сильный элюент, способный обеспечить приемлемые значения фактора удерживания для прочно сорбирующихся компонентов, то слишком рано выйдут плохо удерживаемые вещества, а первые из них - могут и не поделиться друг от друга.

В этом случае выйти из положения позволяет градиентное элюирование. Суть его заключается в создании градиента концентрации сильного компонента (В) во время хроматографического разделения (рис. 1.9). В начале разделения используется слабый элюент, но, либо изначально, либо как только из колонки вышли наиболее слабо сорбирующиеся компоненты, концентрацию в элюенте компонента с большой элюирующей силой (В) начинают плавно повышать и, к концу разделения, она достигает некоторого максимального значения, достаточного, чтобы быстро вымыть из колонки наиболее прочно удерживаемые вещества. К примеру, можно начать разделение при содержании в элюенте 10% компонента В, а закончить - при 60%. Таким образом, каждый из компонентов смеси хроматографируется при наиболее оптимальном составе элюента и достигается их полное и качественное разделение за гораздо меньшее время, чем при изократическом режиме.

Кроме того, при использовании градиента существенно увеличивается максимальное количество пиков, способных разместиться на хроматограмме - пиковая емкость, что весьма немаловажно при разделении сложных многокомпонентных смесей.

Начальную и конечную концентрации компонента В в элюенте, а так же скорость повышения концентрации (крутизну градиента) определяют экспериментально, исходя из состава пробы и свойств используемой хроматографической системы.

Не смотря на свои преимущества, градиентное элюирование таит в себе ряд проблем, и им увлекаться не стоит.

В любом случае, если есть возможность работать в изократическом режиме элюирования, к градиенту лучше не прибегать, поскольку может так оказаться, что некоторая экономия времени, полученная при проведении разделения в градиенте, полностью поглотится затратами времени, необходимого на переход к стартовому составу элюента и уравновешивание им сорбента. Кроме того, использование градиентного элюирования требует повышенной чистоты растворителей, применяемых при изготовлении элюента. В противном случае, примеси в слабом компоненте (А) могут накопиться на начальной стадии хроматографического разделения в колонке и выйти в градиентном режиме в виде ложных пиков (не соответствующих ни одному из компонентов пробы), значительно затрудняя при этом  интерпретацию хроматограммы.