1.5 Сорбенты для жидкостной хроматографии

Рассмотрим подробнее самую важную составляющую хроматографической системы – сорбент. Именно размер частиц, структура и свойства поверхности сорбента в наибольшей степени определяют свойства хроматографической системы и вид жидкостной хроматографии.

В жидкостной хроматографии к материалу сорбента предъявляется ряд достаточно жестких требований.

Во-первых, колоночный материал должен обладать достаточной прочностью и жесткостью, мало зависящей от наличия и состава элюента в колонке.

Во-вторых, сорбент должен обладать достаточно развитой однородной поверхностью и узким фракционным составом частиц.

В-третьих, сорбент не должен вступать в необратимые химические взаимодействия как с компонентами элюента, так и с разделяемой пробой.

Этим требованиям отвечает довольно много неорганических и органических материалов, однако, в плане долговременной стабильности свойств сорбента, воспроизводимости его свойств и величины удельной поверхности, подходящими материалами оказались лишь силикагель и, в гораздо меньшей степени - окись алюминия, которые и получили, в свое время, наибольшее распространение при реализации исторически первого варианта жидкостной хроматографии – нормально-фазовой.

Известны, как уже было сказано, попытки использования в качестве сорбентов для ЖХ и других неорганических материалов, таких как окиси циркония, магния и титана, алюмосиликатов различной структуры, неорганических солей и т.п. Однако, традиционные силикагелевые сорбенты, уступая по некоторым параметрам, значительно превосходили эти материалы по доступности и воспроизводимости свойств, а, кроме того, имели значительно меньшую стоимость.

До сих пор большая часть сорбентов, порядка 75%, выпускаются на основе силикагеля [8], 20% приходятся на полимеры (полиметилметакрилаты, полистиролдивинилбензолы, полиэтиленгликоли, целлюлозы и др.). Чаще всего используются сополимеры стирола с дивинилбензолом. Пористые полимеры в отличие от силикагелей, стабильны во всем диапазоне рН (0-14). Предпочтение этим материалом отдается в ионо-обменной и ионной хроматографии. В эксклюзионной хроматографии, как уже говорилось, используются, в значительной мере, частью, полимеры и синтетические силикагели с широкими порами.

4% сорбентов для ВЭЖХ - пористые углеродные сорбенты. Они считаются наиболее перспективными для ОФХ из-за своей стабильности и уникальной селективности, которая проявляется в основном – к геометрическим и пространственным изомерам. В этой связи известно применение силахромов и микропористых силикагелей со слоем пирографита на поверхности. Существенным недостатком материалов на основе углерода для ВЭЖХ является малая механическая прочность, из-за чего их трудно применять при высоких давлениях.

Весь путь развития и совершенствования жидкостной хроматографии связан с попытками интенсифицировать хроматографический процесс за счет значительного увеличения скорости потока через колонку и общего повышения эффективности хроматографической системы.

Исходя из уравнения Ван-Деемтера (6), где первое слагаемое (коэффициент А) и определяется свойствами сорбента, этого можно достичь, в первую очередь, за счет значительного уменьшения размера частиц сорбента (до 4-5 мкм). Ведь именно размеры частиц сорбента определяют теоретический предел максимально достижимой высоты, эквивалентной теоретической тарелке. ВЭТТ даже тщательно упакованной колонки редко бывает меньше, чем удвоенный средний диаметр частиц используемого сорбента.

При этом неизбежно увеличение сопротивления колонки прохождению потока элюента. Для обеспечения достаточной скорости потока через колонку приходится повышать входное давление, а это долгое время было связано с рядом технических проблем.

Одно время, в стремлении, в первую очередь, снизить давление на входе в колонку были предложены сорбенты, состоящие из твердых кварцевых микрошариков со сформированным тонким слоем пористой поверхности, так называемых - поверхностно-пористых (пелликулярных) материалов. Все технологические ухищрения, однако, не позволили достигнуть необходимой удельной поверхности таких сорбентов, и уже к середине 80-х годов объемно-пористые сорбенты, типичным представителем которых и является силикагель, стали вытеснять пелликулярные и подобные им сорбенты. Во многом, это стало возможным благодаря тому, что проблемы работы при высоком давлении постепенно были преодолены благодаря разработке и широкому применению довольно сложных насосных систем для хроматографии, способных развивать давление до 40 МПа и выше.

Сейчас пелликулярные сорбенты используются почти исключительно для заполнения предколонок, поскольку гораздо легче отмываются от загрязнений, сорбированных из пробы и элюента, чем объемно-пористые сорбенты, а сами предколонки легко ими перезаполнить.

Так в 70-х годах прошлого века появилась колоночная хроматография, работающая при высоком давлении, имеющая гораздо более высокую эффективность и скорость разделения, чем хроматография, где использовались относительно крупные сорбенты (30 – 100 мкм). Вскоре этот вариант жидкостной хроматографии стали называть высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). В  англоязычном варианте эта разновидность ЖХ и до настоящего времени больше известна как HPLC - аббревиатура сочетания английских слов High Performance Liquid Chromatography.  Хотя некоторые авторы второй букве аббревиатуры на тот момент придавали и несколько другой смысл – Pressure, а некоторые, остроумно – Price, что можно было бы перевести, как хроматография высокого давления и, соответственно – хроматография высокой стоимости. Следует признать, что и то, и другое – до сих пор вполне соответствует истине из-за сложности и высокой стоимости оборудования для реализации ВЭЖХ, основная стоимость которого и приходилась на насос, а сейчас - и на детектор.

Тем не менее, обычный силикагель не обеспечивал всего необходимого спектра свойств поверхности сорбента и, примерно в то же время, в практику ВЭЖХ стали входить сорбенты на основе силикагеля, с химически пришитыми тонкими пленками неполярных и среднеполярных неподвижных жидких фаз, благодаря чему стала возможна реализация в ВЭЖХ обращенно-фазного режима.

Действительно, обладая достаточно большой удельной поверхностью (200 – 600 м²/г), силикагель позволял за счет химически активных силанольных групп, химически пришить к своей поверхности самые различные, как правило – неполярные и малополярные, фрагменты органических молекул (-R). Однако, развитая поверхность силикагеля значительно усложняла этот процесс, а за счет стерических затруднений с проникновением реагента в особо тонкие поры, часть поверхности в процессе пришивки достаточно длинных алкильных групп оставалась немодифицированной, но, в то же время, доступной для наиболее низкомолекулярных компонентов пробы. Это создавало некоторые проблемы для пользователей таких сорбентов, связанные с активностью остаточных силанольных групп.

Тем не менее, такие сорбенты стали очень популярны у хроматографистов, и, к концу 80-х годов, на долю колонок с немодифицированным силикагелем (реализация нормально-фазового варианта ВЭЖХ) приходилось не более 10% всех описанных в научной литературе хроматографических разделений. Такая популярность ОФ варианта, по сравнению с НФ, обусловлена в первую очередь более линейной изотермой сорбции большинства сорбатов (особенно полярных), более высокой скоростью установления равновесия элюента с сорбентом и, наконец, большим разнообразием свойств поверхности сорбента, обусловленного многочисленными вариантами химической модификации.

В дальнейшем, производителями материалов для жидкостной хроматографии процесс пришивки различных групп к поверхности силикагеля непрерывно совершенствовался, расширялся ассортимент и улучшалось качество хроматографических сорбентов. Появились эндкепированные сорбенты, в которых остаточные силанольные группы закрывались короткоцепочными углеводородными цепями, возросла плотность прививки и номенклатура прививаемых функциональных групп. Если поначалу ассортимент колонок ограничивался только немодифицированным силикагелем и октадецилсиликагелем (пришитая фаза С18), то в настоящее время серийно выпускаются сорбенты с пришитыми фазами С8 и фенил – для обращенно-фазового режима; NH₂, CN, диол – для нормально-фазового и обращенно-фазового режимов; карбоксил-, тетраалкиламино- и сульфогруппами – для ионообменного.

Сейчас любому хроматографисту стали доступны колонки с ультра мелкими (3-4 мкм) сорбентами на основе силикагеля узкого фракционного состава, причем с такими свойствами и параметрами, о которых раньше приходилось лишь мечтать.

На сегодняшний день, по данным различных источников, в хроматографической литературе и каталогах фирм описаны и выпускаются от 200 до 500 различных типов и наименований сорбентов для колонок ВЭЖХ. Имеет смысл отметить, что многие сорбенты различных фирм близки по химической природе и свойствам поверхности, а отличаются только названием.

Плотность прививки на поверхность силикагеля органической фазы, в зависимости от ее вида, может колебаться от 4 до 18% в пересчете на углерод.

При использовании специальных методов, плотность прививки может достигать 25-30% углерода. Такие сорбенты со сверхплотной прививкой отличаются повышенной емкостью, устойчивостью к коллапсу, гидролитической стойкостью и могут использоваться в обращенно-фазовой хроматографии для широкого круга как аналитических, так и препаративных разделений.

Они разительно отличаются от классических октадецилсиликагелей тем, что полностью не смачиваются водой. В поры же такого сорбента вода может проникнуть только под значительным внешним давлением, преодолевая силы поверхностного натяжения, что позволило кроме хроматографии, с успехом испытать такие сорбенты в технике, в частности - для конструирования амортизаторов - гасителей механического импульса.

Заполнение колонки сорбентом в ВЭЖХ – весьма тонкая и ответственная процедура, требующая навыков, а зачастую – и специального оборудования. Поэтому большинство хроматографистов предпочитают приобретать готовые колонки, уже заполненные сорбентом. Поставляемые пользователю колонки, как правило, имеют паспорт и соответствующий шильдик, где указаны тип и параметры сорбента, а также - направление движения элюента. Наименование типа сорбента, которым заполнена колонка, обычно состоит из фирменного названия, например - «Nucleosil», и краткого обозначения вида химически пришитой фазы (табл. 1.1). Отсутствие такого обозначения или обозначение Sil, как правило, говорит о том, что колонка заполнена обычным, немодифицированным силикагелем.

Таблица 1.1. Сорбенты с привитыми фазами на основе силикагеля

Кроме этого, на колонке может быть указан средний размер зерен сорбента, его удельная поверхность и буквы S или SPH, указывающие на то, что данный сорбент имеет сферическую форму частиц. Впрочем, в настоящее время выпускаются почти исключительно сферические  сорбенты.

В отличие от сорбентов с неправильной формой частиц, сорбенты со сферическими частицами лучше упаковываются в колонку и имеют несколько меньшее (в 1,4-1,7 раза) сопротивление потоку элюента, а потому - более предпочтительны для использования.

В любом случае, при сомнениях в правильности интерпретации наименования сорбента, чтобы не вывести из строя колонку неправильными действиями, лучше обратиться к каталогу фирмы, выпускающей данный сорбент, и ознакомиться с его особенностями и рекомендуемыми областями применения. При этом стоит помнить, что информация в большинстве фирменных каталогов носит рекламный характер, а потому - всецело доверять ей не стоит.

В настоящий момент, благодаря работам ряда исследователей за рубежом, а в России - А. А. Сердана с сотрудниками [3], на рынке хроматографических материалов специалистам стали доступны совершенно уникальные сорбенты - гетероповерхностные (дифильные, RAM) или, как их иногда называют за рубежом - «пинкертоновские», по имени создателя первых прототипов подобных сорбентов [3].

В них поверхность мелких и крупных пор силикагеля модифицированы совершенно различным образом, что позволяет реализовывать на одном и том же элюенте разные механизмы взаимодействия с сорбентом для низкомолекулярных и высокомолекулярных сорбатов. На практике это важно, например, при анализе, биологических проб.

Белки, неизбежно сопутствующие целевым низкомолекулярным анализируемым компонентам пробы, при использовании обычной колонки обязательно быстро вывели бы ее из строя, забив основные поры сорбента. Для предотвращения этого, хроматографисту-аналитику пришлось бы проводить целый ряд операций подготовки и очистки пробы. А это, очевидно, не способствует экспрессности анализа и чревато неприемлемыми потерями определяемых веществ из пробы.

Другое дело – колонки с дифильными сорбентами: при дозировании практически неочищенной от белков пробы, все высокомолекулярные компоненты проскакивают колонку в режиме сорбции, близком к эксклюзионному и выходят между исключенным и мертвым объемом, а целевые низкомолекулярные компоненты делятся по обычному сорбционному механизму. Безусловно, синтез такого сорбента – весьма сложная и тонкая процедура, что известным образом отражается на воспроизводимости его свойств и стоимости. Тем не менее, для многих задач использование этих сорбентов оказалось оправданным, и объемы производства ведущими мировыми фирмами колонок с дифильными (гетероповерхностными) сорбентами неуклонно растут.

Не потерял своего значения в хроматографической практике и неизмененный силикагель, а потому каждая уважающая себя фирма, производящая хроматографические материалы, обязательно включает в свой ассортимент колонки с этим сорбентом.

Таблица 1.2. Некоторые новые сорбенты для специальных применений.

 

Именно на силикагеле реализуются нетрадиционные методы разделения, которые можно объединить названием - гидрофильная  хроматография. За рубежом этот, пока не очень распространенный вариант применения силикагеля в водосодержащих элюентах, часто называют HILIC (Нydrophilic Interaction LIquid Chromatography), что касается альтернативных силикагелю материалов, то на настоящий момент и здесь - налицо существенный прогресс.

Для особо жестких условий разделения (повышенная температура, рН) серийно выпускаются сорбенты на основе оксида циркония, с том числе и с химически измененной поверхностью. Правда, этот вид сорбентов остается пока экзотикой, и на нем производят лишь незначительную часть всех реализуемых на практике хроматографических разделений, что обусловлено довольно высокой их стоимостью.

Следует отметить появившийся в последнее время ряд сорбентов на основе сверхсшитого полистирола, которые также могут составить  конкуренцию сорбентам на основе силикагеля, поскольку обладают гидролитической устойчивостью и специфическими свойствами, принципиально недоступными сорбентам на основе силикагеля. В ВЭЖХ эти сорбенты получили распространение исключительно благодаря разработкам В.А. Даванкова с сотрудниками [7].

От своих не очень удачных предшественников эти полимерные сорбенты выгодно отличаются значительно большей жесткостью, воспроизводимостью свойств и сорбционной емкостью. Учитывая это, следует признать, что у полимерных пористых материалов появилась наконец перспектива занять достойное место, как в практике жидкостной хроматографии, так и в граничном ее варианте – твердофазной экстракции (ТФЭ), широко используемой в настоящее время для подготовки проб.

В табл. 1.2 приведены некоторые новые типы сорбентов, которые доступны на рынке хроматографических материалов.

Следует отметить, что основным препятствием широкого внедрения новых типов сорбентов является далеко  не их высокая стоимость. Даже если представить, что появился вдруг совершенно идеальный сорбент для ВЭЖХ, он не скоро смог бы вытеснить классические сорбенты на основе  силикагеля. И дело даже не в некоторой консервативности хроматографистов, хотя и она имеет место быть. Ведь не секрет, что многие практики ВЭЖХ исходят из принципа: «лучшее – враг хорошего».

Гораздо более значимо то, что за весьма продолжительное время активного прикладного использования ВЭЖХ, разработано  огромное множество приложений и методик, выполненных на химически модифицированном или неизмененном силикагеле. Эти методики внесены в различные нормативные документы, прошедшие немалое количество согласований в разных инстанциях. Заменить сорбент для разработчиков хроматографических методик анализа, означает не только большой объем экспериментальных работ с неясной перспективой их финансирования, но и повторное прохождение всех бюрократических инстанций, связанное с легитимизацией нового варианта методики, сколь много практических благ этот вариант бы ни сулил.

Во многом, именно поэтому новые сорбенты для ВЭЖХ с трудом пробивают себе дорогу даже в тех областях и приложениях, где имеют неоспоримое преимущество перед сорбентами на основе силикагеля. 

Таким образом, как и десятки лет назад, силикагели, пусть и значительно улучшенные в соответствии с развитием методов их синтеза, по-прежнему составляют основу сорбентов в ВЭЖХ. И тенденций к кардинальному изменению такого положения, по крайней мере, в течение еще десятка – другого ближайших лет, пока не наблюдается.