Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

ТФЭ - ВЭЖХ деоксирибонуклеозида >>>

  Ответов в этой теме: 32
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: ТФЭ - ВЭЖХ деоксирибонуклеозида
romich_s
Пользователь
Ранг: 5

05.05.2010 // 17:03:22     
Редактировано 2 раз(а)

Уважаемые химики! Отрабатываем методику анализа 8-оксо-7,8-дигидро-2'-деоксигуанозина ( 8 OxodG, 8 OHdG) в моче методом ВЭЖХ (C18, 150x2, 2um) с амперометрической детекцией. Процедура: ТФЭ мочи в PBS(pH 7.0) на картридже Oasis HLB, элюция 10%МЕОН в воде без промывки, затем сушка и растворение в воде. Объём инъжекции 10ul, ПФ 50mM фосфатно-цитратный буфер (pH 4.3) с EDTA + 1%MEOH, стеклоуглеродный электрод, +600mV. Столкнулись с рядом затруднений:
1. При таких хром.условиях время анализа длительное (k'=28), пик очень широкий, однако увеличение % MEOH приводит неполному разделению oxodG и соседних пиков. Хотя чистый стандарт можно элюировать 12% MEOH с k' около 4-5. Пытались менять pH ПФ, однако при pH 3.1 (также как при разведении стандарта oxodG кислотой) oxodG "выскакивает" в мёртвом объёме. Известно, что обладает таутомерией: один таутомер имеет pKa около 3, другой - 7.5. Ч
2. В пробе очень много "ненужных" веществ, выходящих перед oxodG и высокий фоновый ток. Однако промывка образца при ТФЭ даже 5%МЕОН приводит к потере 50% oxodG. Имеем картриджи Oasis MCX (катионообменные), пробовали ТФЭ на них по схеме загрузка в PBS, затем промывка кислотой, потом 100%ME, потом NH3 в MEOH и воде. Однако, 50% oxodG смывается 100%ME, остальные 50% - NH3 в ME c водой.
3. Сами не являемся специалистами в области хроматографии и химии, следовательно способны совершать грубые ошибки.
Может быть у кого-то есть опыт анализа oxodG или других нуклеозидов, мысли по поводу оптимизации/корректировки методики. Спасибо!
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
virtu
VIP Member
Ранг: 2119


05.05.2010 // 20:46:56     
Мысли:
1. ВЭЖХ
Элюент: 50-100mM CH3COONa, СF3COONH4 (+MeCN or/and MeOH), только не забудьте смотреть совместимость компонентов элюента и стеклоуглеродного электрода (!!!).
ЭДТА Вы добавляли по статье или... ? Сорбент у Вас тот же самый, что и в статье?

Можно порекомендовать еще HILIC на Sil, в качестве элюента MeCN 70-80% + 50-100mM CH3COONH4 (pH=4-5), 0,1% АсОН, 0,1%HCOOH и т.д.

2. ТФЭ
а) HLB: Кондиционируете водой или лучше вода+0.5-2%vNH4OH, рН>7 (sample), промывка 2-5%v MeOH + 0.5-2%v NH4OHaq., затем просто водой (возможно, этот шаг надо будет опустить или добавить немного NH4OH) или каким либо буфером(рН>=7), а затем элюируете 5-15%MeOH + 0.1%HCOOH
б) MCX: Пробу подкисляете не сильно, "загружаете", промываете 5%MeOH +... (рН=2-4), затем 50%МеОН +... (рН=2-4), затем элюируете 1-2% NH4OH in 70-100%MeOH (MeCN).

Но, думается, данный подход не уберет полностью "лесок" перед целевым аналитом.

Остается только оптимизировать.

З.Ы.: С данным аналитом не работал.
eds
Пользователь
Ранг: 2


06.05.2010 // 15:14:58     
Какой хроматограф? Какой фирмы детектор? Пишите на почту eds123{coбaчkа}mail.ru Попробуем помочь.
Serga
Пользователь
Ранг: 1806


06.05.2010 // 19:59:23     

eds пишет:
Какой хроматограф? Какой фирмы детектор?
А что это принципиально изменит, если вы будете знать- какой и чей??? Статей море по его веществу. Там плохо написано?
eds
Пользователь
Ранг: 2


06.05.2010 // 22:56:44     

Serga пишет:

eds пишет:
Какой хроматограф? Какой фирмы детектор?
А что это принципиально изменит, если вы будете знать- какой и чей??? Статей море по его веществу. Там плохо написано?


И везде написано на каком оборудовании это делалось. Собственно я не настаиваю. Нет, так нет. Значит не очень надо.
Serga
Пользователь
Ранг: 1806


07.05.2010 // 7:21:22     

eds пишет:
И везде написано на каком оборудовании это делалось. Собственно я не настаиваю.
В данном конкретном случае принципиальны только материал SPE и аналитическая колонка ВЭЖХ (материал сорбента и т.д.). Чей прибор и детектор- пофиг. Им нужно решать хроматографическую задачу прежде всего.
По их (модной теперь) проблеме- море статеек. Они пытаются воспроизвести наиболее распространенный вариант. Но есть и кучка других статей. Пусть изучают. Да, не всегда нехимикам удается легко выходить из положения, поскольку не хватает "теоретических основ", чтоб додумать и доделать методу, которая "не очень идет".
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
ФР.1.31.2010.07433   (ПНД Ф 14.1:2.189-02) ФР.1.31.2010.07433 (ПНД Ф 14.1:2.189-02) "Методика выполнения измерений массовой концентрации жиров в природных и очищенных сточных водах методом ИК-спектрофотометрии на концентратомере КН-2м"
Диапазон измерения массовых концентраций жиров в природных и сточных водах от 0,1 до 100,0 мг/дм3
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
romich_s
Пользователь
Ранг: 5


07.05.2010 // 9:05:25     
Редактировано 1 раз(а)


virtu пишет:
ЭДТА Вы добавляли по статье или... ? Сорбент у Вас тот же самый, что и в статье?

В некоторых работах используют ЭДТА (но не во всех). Сорбент у нас Luna2(C18), его использование для данного аналита не встречал... Спасибо за мысли, будем пробовать!
romich_s
Пользователь
Ранг: 5


07.05.2010 // 9:38:27     
Редактировано 3 раз(а)


Serga пишет:
По их (модной теперь) проблеме- море статеек. Они пытаются воспроизвести наиболее распространенный вариант. Но есть и кучка других статей. Пусть изучают. Да, не всегда нехимикам удается легко выходить из положения, поскольку не хватает "теоретических основ"....
Да, действительно, статей море. Рабочих/подходящих методик - мало. Наиболее распространённый вариант - LC-MS with on-line anionexchange extraction. Либо, вообще, ELISA. Из электрохимической детекции - зачастую кулонометрический метод с несколькими электродами. Спектр используемых сорбентов и ПФ в работах довольно большой. Колонки, зачастую, препаративные. Но, недавнее исследование Европейского Комитета Стандартов по анализу повреждения ДНК в моче показало, что многие лаборатории (в том числе те, которые публикуют статьи по данной проблеме) не смогли с должной точностью проанализировать предложенные им образцы. (Marcus S. Cooke et al. Toward consensus in the analysis of urinary 8 Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine as a noninvasive biomarker of oxidative stress. FASEB J. 2010 Apr;24(4):1249-60.) У нас, в большей части, должна получиться своя методика. Serga, если у Вас есть какая-либо, на Ваш взгляд полезная, статья - поделитесь, пожалуйста. А в форум именно потому и обратились, что есть "теоретическая нехватка" хим.основ (см. п.3, сообщение 1) и хотелось бы конструктивных предложений...
Serga
Пользователь
Ранг: 1806


07.05.2010 // 13:23:10     
Редактировано 1 раз(а)


romich_s пишет:
и хотелось бы конструктивных предложений...
Напрягите химиков, пусть подскажут, как проэксплуатировать свойства аналита образовывать заряды. От ваших финансовых возможностей тоже зависит немало. И читайте, читайте... Все подряд, что касается именно выбранного вами способа анлиза (а не ELISA, и не LC-MS). Способы пробоподготовки годятся из любого источника. Так что, читайте и анализируйте.
virtu
VIP Member
Ранг: 2119


07.05.2010 // 16:08:53     

romich_s пишет:
В некоторых работах используют ЭДТА (но не во всех). Сорбент у нас Luna2(C18), его использование для данного аналита не встречал... Спасибо за мысли, будем пробовать!


С данным сорбентом (Luna C18(2)) ЭДТА можно не использовать. Конечно, я бы еще Ваш элюент изменил (уже приводил как).

А внутренний стандарт уже подобрали?
romich_s
Пользователь
Ранг: 5


07.05.2010 // 18:30:06     

virtu пишет:
А внутренний стандарт уже подобрали?
Нет, к сожалению. Слышал, что ацикловир в качестве стандарта используется. Ещё меченый oxodG применяют, но это, кажется, только для MS. Надеюсь, Ваш элюент удастся попробовать. О результате дам знать...

  Ответов в этой теме: 32
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты