| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Различные отклики при использовании разного ацетонитрила >>>
|
 |
| Автор | Тема: Различные отклики при использовании разного ацетонитрила | ||
|
boberk Пользователь Ранг: 105 |
 27.12.2011 // 11:13:18
Редактировано 8 раз(а) Добрый день. Разрешите обратиться за консультацией. Ситуация следующая: на протяжении 2 лет использовали хроматографический метод для определения концентрации белка. Хроматограмма имела постоянный вид. Подвижные фазы: A)H2O(pH=2 ТФУ) B) ACN/H2O=90/10(pH=2 ТФУ) Градиент 0% - 0мин 100% - 14мин Однако месяц назад вид хроматограммы существенно изменился (см. Рис). Предположили, что это связано с плохим качеством ACN. Использовали ACN пропущенный через колонку и затем перегнанный. Вид хроматограммы вернулся к прежнему. Однако главным было то, что и отклик белка на предположительно плохом ацетонитриле увеличился в 5 раз при детекции на 215 нм. На приведенном рисунке концентрация белка одинакова. Верхняя хроматограмма отвечает регенерированному ацетонитрилу и соответствует стандартному виду на протяжении 2 лет, нижняя-предположительно плохому ацетонитрилу. Вопрос: С чем может быть связан, по Вашему мнению, этот факт? Заранее большое спасибо за помощь. 
|
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
makcity Пользователь Ранг: 2 |
27.12.2011 // 12:25:10
А вы какой квалификацией ACN пользуетесь? |
||
|
Kalambet Пользователь Ранг: 484 |
27.12.2011 // 12:32:18
Ваш плохой ацетонитрил на самом деле оказался хорошим. На 215нм очень мало света и, соответственно, большая ошибка измерения. Если посмотреть на УФ спектр, то в районе 215 он будет иметь максимум и при более коротких длинах волн скорее всего начнет загибаться вниз (чисто аппаратный эффект, не имеющий отношения к "настоящему" спектру белка), причем положение максимума зависит от количества света, т.е. от оптической чистоты ацетонитрила. Чем чище ацетонитрил, тем ближе к 190 сдвигается максимум. Длину волны детектирования белка следует выбирать так, чтобы замена растворителя не слишком влияла на отклик - т.е. ближе к 220-230 (а то и 280) нм. Поскольку вам все равно перекалибровываться - одновременно с перекалибровкой смените длину волны. |
||
|
boberk Пользователь Ранг: 105 |
27.12.2011 // 13:17:16
Спасибо за совет. Действительно, при детектировании на 280 нм различия в площадях не превышают 5%. Однако чем можно объяснить такое различие профилей хроматограмм? Ведь в случае плавного увеличения доли ацетонитрила и подъем должен быть плавным? |
||
|
boberk Пользователь Ранг: 105 |
27.12.2011 // 13:36:13
Acetonitrile EMPLURA® |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
27.12.2011 // 16:33:55
Редактировано 2 раз(а) 1. Наиболее вероятно, что дело в ТФУК (деградация, испарение и т.д. в пользу этой версии - уменьшение удерживания и "фона"). А в общем, у Вас просто "фон" разный, соотв. и площади пиков тоже. 2. ВЭЖХ условия (градиент, как минимум) нужно оптимизировать. Градиент слишком "кривой", да и в "B" должна быть ТФУК. "Некрасивые же картинки"  3. Рекомендую, если есть возможность, использовать 280нм. В общем, чтобы там ни писали, при ОФ ВЭЖХ с ТФУК, если белок "поглощает" при 260-280нм, то лучше использовать 260-280нм, чем 210-220нм. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
boberk Пользователь Ранг: 105 |
27.12.2011 // 16:45:05
Большое спасибо. На самом деле, в B тоже есть ТФУ. Ошибся. А какая из этих хроматограмм ближе к истинной по профилю? |
||
|
virtu VIP Member Ранг: 2135 |
27.12.2011 // 16:48:38
Это Вы должны сказать
|
||
|
Kalambet Пользователь Ранг: 484 |
28.12.2011 // 8:45:37
Редактировано 1 раз(а) Несложно заметить, что профиль с новым ацетонитрилом ближе к линейному росту, чем со старым. Со старым у вас относительно правильный профиль только до уровня около 1500мВ. Дальше идет зашкал детектора и показаниям верить не стоит. У большинства детекторов на выходе 1AU/1V и выше 1.5AU света на детекторе почти нет и он нелинеен. Если вам хватает чувствительности на 280, пользуйтесь 280 - там у белка локальный максимум и детектирование очень надежное. В короткие длины волн имеет смысл двигаться, если не хватает чувствительности на 280 и нужно ловить следовые количества белка. |
||
|
Волгин VIP Member Ранг: 1327 |
28.12.2011 // 13:04:25
Добавлю свои 5 копеек. В ацетонитриле, там где S=251 присутствуют примеси, которые не сразу выходят из колонки, а сначала накапливаются, а затем начинают смываться в процессе градиента. Этим объясняется непрямолинейность кривой. Примесей много и их поглощение сравнимо с поглощением Вашего белка, поэтому пик маленький на их фоне. В случае S=1090 примесей существенно меньше, поэтому и пик выше. |
||
|
Kalambet Пользователь Ранг: 484 |
28.12.2011 // 20:13:32
Юра, на фоне такого зашкала по-моему, никакие примеси увидеть невозможно - только килограмм белка. А нелинейность вполне объясняется зашкалом - чем больше процент ацетонитрила, тем больше поглощение раствора, а выше 1...1.5AU все детекторы с оптическим путем 1см нелинейны. А белок виден на фоне 2500 mV, т.е. 2.5ЕОП! Никакой чувствительности там и в помине быть не может - непонятно, как белок вообще увидели. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
