| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Спектрофотометрическое определение Днк Рнк >>>
|
 |
| Автор | Тема: Спектрофотометрическое определение Днк Рнк | ||
|
Чайник Пользователь Ранг: 33 |
 13.02.2006 // 18:36:40
Химикам – аналитикам салют. Нашел старинную (не старую, а старинную) методику спектрофотометрического определения нуклеиновых кислот. В методике написано: …«Измерения производили в фотометре Пульфриха при фильтре S66 для рибозы и S61 для дезоксирибозы». … Подскажите, пожалуйста, что такое S66 и S61, при какой длине волны проводить измерения на сф или кфк. Спасибо. |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
Фантом из той же оперы Пользователь Ранг: 6 |
13.02.2006 // 23:32:35
260 |
||
|
Чайник Пользователь Ранг: 33 |
14.02.2006 // 0:31:38
260 нм для какого фильтра? |
||
|
kot Пользователь Ранг: 2028 |
14.02.2006 // 9:52:52
240,260 затем смотрим соотношение |
||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
14.02.2006 // 13:09:41
Редактировано 1 раз(а) I. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Методы количественного определения нуклеиновых кислот, осно ванные на спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра отличаются высокой чувствительностью и простотой проведения ана лиза. Необходимым этапом различных методов спектрофотометрии ского определения нуклеиновых кислот является их экстракция из биологического материала, сопряженная с гидролизом полинуклеоти-дов. В связи с этим следует иметь в виду, что из исследуемого материала предварительно необходимо удалить свободные нуклеотиды. В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанное А. С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм. Автор предложил также формулу для расчета содержания нуклеиновых кислот. Реактивы: 1. НСlO4 — 0,2 н. и 0,5 н. растворы. Измельченную на холоде навеску ткани (100—200 мг) помещают в центрифужную пробирку с 5—10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают л осадок отделяют центрифугированием на холоде (3000 g, 10 мин). Центрифугат отбрасывают и осадок повторно отмывают хлорной кия лотой. Такая предварительная обработка материала необходима для удаления кислоторастворимых нуклеотидов. После удаления центрифугата к осадку добавляют 5—10 мл 0,5 н. раствора НС1О4 и, закрыв пробирки пробками с воздушным холодильником, нагревают их в кия пящей водяной бане в течение 30 мин. Эта процедура обеспечивает количественную экстракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала и их кислотный гидролиз до растворимых фрагментов. Гидро-лизаты охлаждают и центрифугируют. Осадок подвергают повторном экстракции 0,5 н. НС1О4. Гидролизаты объединяют и определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против контрольного раствора — 0,5 н. раствора НС1О4. При необходимости гидролизаты разводят тем же раствором. Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл ис-следуемого раствора по формуле: CмкгФн = (А270-А290)/0,19 где 0,19 — значение (дельта)А (А270—А290), которое имеет гидролизат нуклеи-новых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора. При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются средним пересчетным коэффициентом 10,3: Смкг НК = СмкгФн *10,3 Рекомендуется проводить дополнительное определение оптической плотности при 260 нм; оптическая плотность при 260 и 270 нм не должна различаться более чем на ±15%. Есть еще метод с реактивом Дише по пентозе и по фосфору. Так что методов достаточно. |
||
|
Чайник Пользователь Ранг: 33 |
14.02.2006 // 16:04:01
Благодарю Вас, Garry. Вы предлагаете спектрофотометрическое определение суммы ДНК+РНК. Пробовал. Не понравилось. Проблема вот в чем. Хлорная кислота гидролизует все: и нуклеиновые кислоты и белки. И вот эти ароматические аминокислоты маскируют Днковые(РНКовые) азотистые основания. В спектре получается один большой пик на 258-268нм – т.е. белок. На 270-280 нм прямая линия. У меня есть методика (раздельное определение содержания гидролизованных ДНК-нуклеотидов и РНК-нуклеотидов, модификация метода Шмидта – Тангаузера). А Вот прибора фотометра Пульфриха с фильтрами S66 и S61 нет. Что за зверь – никто не знает. По видимому очень популярен был в 60-е годы. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
14.02.2006 // 16:32:15
Редактировано 2 раз(а) 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ПЕНТОЗЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ДНК С ДИФЕНИЛАМИНОМ ПО ДИШЕ Метод основан на реакции между дифениламином и дезоксирибо-зой, отщепляющейся от пуриновых нуклеотидов в результате кислотно-го гидролиза. N-гликозидная связь в пиримидиновых нуклеотидах при этом не разрушается и вследствие этого определяется лишь около по-ловины углевода, входящего в состав ДНК; поэтому рекомендуется в качестве стандарта использовать гидролизат ДНК, концентрацию ко-торого предварительно определяют спектрофотометрическим методом. Реактивы: 1. НС1О4 — 0,5 н. раствор. 2. Реактив Дише: 1 г дифениламина (перекристаллизованного из 70%-ного этилового спирта) растворяют в 100 мл ледяной ук- сусной кислоты (х. ч.) и добавляют 2,75 мл концентрированной H2SO4. 3. Стандартный раствор ДНК — 0,5 мг/мл. Навеску коммерческого препарата ДНК растворяют в 0,5 н. НС1О4 и нагревают 15 мин при 70°С; для определения точной концентрации гидролизат разводят в 50 раз 0,5 н. раствором НСЮ4 и измеряют поглоще- ние на спектрофотометре так, как это описано на с. 162. К 1—2 мл кислотного гидролизата ткани добавляют двойной объ-ем реактива Дише. Смесь нагревают в течение 10 мин на водяной бане при 90°С и охлаждают. Одновременно проводят реакцию со стандарт-ным раствором ДНК, содержащим от 50 до 500 мкг ДНК в пробе. При нагревании развивается устойчивая синяя окраска. Измеряют по-глощение растворов на колориметре при 590 нм. Содержание ДНК в ткани рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору ДНК, с учетом всех разведений. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ РНК С ОРЦИНОМ ПО МЕЙБАУМ Метод основан на реакции рибозы, входящей в состав РНК, с ор-цином. В результате гидролиза РНК в присутствии соляной кислоты образуется производное фурфурола, дающее при нагревании с орци-ном продукт зеленого цвета. Реакция не является высокоспецифичной: окрашенные продукты образуют дезоксирибоза, гексозы, полисахари-ды, а также некоторые другие соединения, однако чувствительность реакции орцина с рибозой намного выше. Реактивы: 1. FeCl3 — 0,1%-ный раствор, приготовленный на концентрирован- ной НС1. 2. Орцин — 0,5%-ный раствор, готовят на растворе FeCl3 (п. 1) перед употреблением. 3. Стандартный раствор РНК — 0,1 мг/мл. Навеску коммерческого препарата РНК растворяют в 0,5 н. НС1О4 , кипятят в течение 15 мин и измеряют поглощение на спектрофотометре (с. 162). 4. НС1О4 — 0,5 н. раствор. К 2 мл исследуемого раствора, содержащего от 10 до 80 мкг РНК, приливают 2 мл раствора орцина, перемешивают и нагревают 20 мин на кипящей водяной бане. Пробы охлаждают и колориметрируют при: 670 нм. Содержание РНК рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору РНК. 4. РАЗДЕЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РНК И ДНК В ТКАНЯХ (ПО МЕТОДУ ШМИДТА—ТАННГАУЗЕРА) В основе метода лежит разделение РНК и ДНК путем гидролиза исследуемого материала слабой щелочью, при котором происходит расщепление РНК по З',5'-фосфодиэфирным связям до мононуклеоти-дов. В этих условиях ДНК устойчива к действию щелочи, что делает возможным выделение ее в виде осадка. Определение РНК Реактивы: 1. НС1О4 — концентрированная, 0,2 н. и 2%-ный растворы. 2. КОН — 0,75 н. и 40%-ный растворы. 3. Этиловый спирт. 4. Эфир. Обработку ткани см. на с. 163. Все операции следует проводить быстро и на холоде, чтобы избежать энзиматической и кислотной де-струкции нуклеиновых кислот. К высушенному материалу добавляют 0,75 н. раствор КОН (из расчета 1 мл щелочи на 100 мг сухого материала) и проводят гидролиз при 37°С в течение 18 ч (или 5 мин при кипячении). После гидролиза суспензию охлаждают до 0°С и нейтрализуют по лакмусу хлорной кислотой. К нейтрализованной смеси добавляют концентрированную НС1О4 до конечной концентрации 1—2% и после интенсивного перемешивания смесь центрифугируют на холоде при 5000 g в течение 15 мин. После отделения супернатанта, содержащего рибомононуклео-тиды, осадок дважды промывают 1 мл 2%-ного раствора НС1О4. Цен-трифугаты объединяют, нейтрализуют 40%-ным раствором КОН по бромфеноловому синему и оставляют в холодильнике на 1—3 ч; выпавший осадок КС1О4 отделяют центрифугированием и отбрасывают, центрифугат используют для определения общего содержания рибонуклеиновых кислот спектрофотометрически (с. 162) или по цветной реакции на рибозу (с. 164), а также для определения нуклеотидного состава (с. 180). Определение ДНК Выделение препаратов ДНК с использованием метода Шмидта— Таннгаузера и освобождение их от белков могут быть проведены различными способами. В модификации, предложенной А. С. Орловым и Е. И. Орловой, щелочной гидролиз тканевых препаратов проводят без предварительного выделения нуклеиновых кислот и удаления свобод-ных нуклеотидов. ДНК отделяют от белков и осаждают спиртом. Реактивы: 1. NaOH—1 н. раствор. 2. NaCl — насыщенный раствор в 20%-ном растворе СН3СООН. 3. НClO4 — 0,5 н. раствор. 4. Этиловый спирт. 50—100 мг ткани помещают в центрифужную пробирку, добавляют 1 мл 1 н. раствора едкого натра и при помешивании нагревают в ки-пящей водяной бане в течение 5 мин (нагревание можно заменить ин-кубацией при 37°С в течение 18 ч). Прозрачный, слегка опалесцирую-щий гидролизат охлаждают до комнатной температуры и погружают в сосуд с тающим льдом. Добавляют 0,5 мл насыщенного раствора хлористого натрия, приготовленного на 20%-ном растворе уксусной кислоты. Через 3—5 мин выпавший в осадок белок отделяют центри-фугированием (4°С, 600 g, 10 мин). Центрифугат сливают в стакан, осадок белка растворяют на холоде в 1 мл 1 н. раствора щелочи и белки вновь осаждают добавлением 0,5 мл NaCl. Раствор центрифу-гируют. Центрифугаты объединяют и для осаждения ДНК приливают в стакан с тройным объемом охлажденного этанола. Раствор остав-ляют на 1—2 ч в холодильнике и осадок ДНК собирают центрифуги-рованием на холоде (600g, 10 мин). К осадку добавляют 5 мл 0,5 н. раствора НClO4 , закрывают пробками с воздушными холодильниками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. В гидролизате опре-деляют содержание ДНК спектрофотометрически (с. 162) и по реакции с дифениламином (с. 163). ЛИТЕРАТУРА 1. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.., 1976. 2. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нук леиновых кислот//Биохимия. 1958. Т. 23, № 4. С. 656. 3. О р л о в А. С, Орлова Е. И. Простая методика количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в животных тканях//Биохимия. 1961. Т. 26, № 5. С. 834. |
||
|
Чайник Пользователь Ранг: 33 |
14.02.2006 // 20:28:02
Вся беда в том, что у меня нет дорогих коммерческих ДНК и РНК человека. Тогда можно сделать гидролиз, прописать спектр, найти характерные пики (отпадает необходимость поиска фильтров S66 и S61). Для ДНК в этом случае пик при 260 нм.(литературные данные). Второй шаг – проведение гидролиза смеси: коммерческая ДНК + набор ароматических аминокислот небольшой концентрации. Максимум пиков смещается (260-280нм). Применяем правило аддитивности. Третий шаг – к исследуемой пробе добавляем известное количество коммерческой ДНК и проводим гидролиз (метод добавок) Узнаем реальное количество ДНК – нуклеотидов. Половина проблемы решена. Осталось научиться качественно высаждать белки. Я пробовал сделать гидролиз ДНК РНК по методу Шмидта – Тангаузера. Во всех модификациях, где сыпется хлопьями перхлорат калия, есть потери. Видимо, с хлопьями осаждается часть нуклеотидов. Это обнаружилось при промывании осадка. Модификации метода, в которых белок осаждают трихлоруксусной кислотой, мало информативны. Трихлоруксусная кислота светится в УФ, как раз там, где светится ДНК/РНК. Осталось попробовать фотоколориметрию с дифениламином и орцином, а также метод Ш-Т в модификации Орлова-Орловой (там не сыпется перхлорат калия). На это надо чуток времени. О результатах позже. Может кто-нибудь делал подобное? Ваши впечатления. |
||
|
Фантом из той же оперы Пользователь Ранг: 6 |
14.02.2006 // 21:33:06
Вы определитесь с какой точностью Вам всё это нужно и для чего. Может и не надо ничего гидролизовать. От большинства белков ДНК можно отделить на ДЕАЕ, она будет держаться заметно прочнее. Т.е. белки практически полностью сойдут милимолях в 300 поваренной соли. Потом снимете ДНК в 1 М. Это для нейтрального раствора. Условия лучше подбить. Кроме того, нуклеотиды поглощают значительно сильнее белков. Одноцепочечная и двухцепочечная ДНК поглощают по-разному, так что лучше её надежно денатурировать для измерения. Вам именно человеческая нужна? Если нет, то пообщайтесь с биологами. Могут и дать немного. Или много, если грязной. Из бактеров можно навыделять чертову уйму - сотни мг - в лёгкую. Ну и вот тут немного про измерение ДНК. Это не аналитика, но всё же. |
||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
15.02.2006 // 12:09:18
Ну тогда можно попробовать вот это: 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ФОСФОРУ Определение по фосфору считается наиболее надежным методом оценки количества нуклеиновых кислот, так как его процентное содер-жание в наименьшей степени зависит от пуклеотидного состава: для ДНК оно составляет 9,8—10,1%, для РНК —9,1—9,6 (Исходя из содержания фосфата при спектрофотометрическом определении пересчетный коэффициент для ДНК составляет 10,1, для РНК – 10,5). При определе-нии фосфора нуклеиновых кислот в тканях необходимо предварительно удалить свободные нуклеотиды, неорганический фосфат, а также все фосфорсодержащие соединения ненуклеотидной природы, в частности липиды. Реактивы: 1. НСЮ4 — концентрированная и 0,2 н. раствор. 2. Этиловый спирт 96%-ный. 3. Эфир. 4. Реактивы для определения общего фосфора (с. 34). Измельченную на холоде навеску ткани (100—200 мг) помещают в центрифужную пробирку с 10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлор-ной кислоты, тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифу-гированием на холоде (3000 g, 10 мин). Центрифугат отбрасывают, осадок отмывают повторно хлорной кислотой. Затем осадок промывают 5—10 мл охлажденного спирта для удаления кислоты и два раза смесью спирта с эфиром (1:1) при комнатной температуре для удале-ния липидов и пигментов. В заключение осадок обрабатывают эфиром и оставляют в вакуум-эксикаторе. Для проведения минерализации высушенный материал переносят в колбу Кьельдаля или тугоплавкую пробирку и добавляют 0,3 мл смеси хлорной и серной кислот. Дальнейшие операции см. ниже 15. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ФОСФОРА Общим фосфором (Фобщ) называют весь фосфор, содержащийся в данной пробе, т. е. сумму неорганического фосфата (Фн) и фосфора, входящего в состав органических соединений (Форг). Для определения Фобщ исследуемый раствор или ткань сжигают (минерализуют), нагре-вая с концентрированной H2SO4 в присутствии различных окислителей (Н2О2, КМnО4). Наиболее широко используют пергидроль (30%-ный раствор перекиси водорода). Н2О2 при нагревании легко разлагается я не мешает колориметрическому определению фосфата. Реактивы: 1. H2SO4 — концентрированная. 2. NaOH — 0,5 н. и 5 н. растворы. 3. Реактивы для определения фосфора (с. 34). 4. Пергидроль. 5. Фенолфталеин — 0,5%-ный спиртовой раствор. Минерализация. Количество взятого на минерализацию раствора зависит от содержания в анализируемом фосфорсодержащем органиче-ском соединении фосфата и от чувствительности используемого для определения фосфата метода. При определении неорганического фос-фата методом Фиске—Суббароу на минерализацию берут такое коли-чество исследуемого раствора, чтобы в 1 мл полученного после мине-рализации и нейтрализации раствора содержалось от 0,2 до 1,0 мкмоль фосфата. 1—2 мл взятого на анализ раствора помещают в небольшую колбу для сжигания (колбу Кьельдаля) или жаростойкую пробирку, добавляют 0,3 мл концентрированной серной кислоты и, укрепив кол-бу (пробирку) слегка наклонно, осторожно нагревают раствор на го-релке, песчаной бане или на специальной электрической плитке до тех пор, пока почти полностью выпарится вода и раствор в колбе приобре-тет бурую окраску (если органического вещества в пробе мало, то по-бурения можно и не заметить). После этого колбу (пробирку) охлаж- дают, добавляют 2—3 капли пергидроля и раствор снова нагревают в течение 5—10 мин. Если раствор при этом побуреет, добавляют новую порцию пергидроля. При добавлении пергидроля следят за тем, чтобы он попал в раствор, а не на стенки колбы или пробирки. Нагрев при минерализации не должен быть слишком сильным, нельзя допускать, чтобы тяжелые белые пары H2SO4 и окиси серы выходили из колбы, так как вместе с ними может частично увлекаться фосфат. Рекомендуется проводить минерализацию в колбах, прикрытых стеклянными втулками или маленькими воронками, которые вставляют, когда вода почти испарится. Одновременно с анализируемыми пробами минерализацию проводят в контрольной «слепой» пробе, содержащей вместо исследуемого раствора воду. Необходимость контроля обусловлена тем, что используемые при минерализации реактивы могут содержать следы фосфорной, а также кремневой кислоты, присутствие которых может завысить результаты при определении общего фосфора. При расчете содержания фосфата в исследуемом образце учитывают величину оптической плотности «слепой» пробы. Если значение оптической плотности велико, реактивы следует сменить. Определение фосфора. По окончании минерализации содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу на 25 мл или в мерную пробирку на 10 мл, добавляя небольшими порциями воду и тща- тельно ополаскивая колбу Кьельдаля. Первую порцию воды в колбу Кьельдаля следует добавить очень осторожно, так как при этом происходит сильное разогревание раствора и создаются условия для гидролиза пирофосфата, который может образоваться в процессе минерализации при длительном нагревании фосфата с концентрированной серной кислотой. В мерную колбу или пробирку, заполненную прибли- зительно наполовину разбавленным минерализатом, добавляют 1—2 капли фенолфталеина и нейтрализуют кислоту сначала 5 н., а за- тем 0,5 н. раствором щелочи до слаборозовой окраски, доводят водой до метки и перемешивают. Из каждой колбы (пробирки) отбирают по две параллельные пробы и проводят определение неорганического фосфата (с. 33). При содержании в образце небольших количеств фос- фата (до 0,1 мкмоль на пробу) удобно пользоваться методом, предложенным Бартлеттом (с. 48). МЕТОД ФИСКЕ—СУББАРОУ Метод позволяет определить от 0,2 до 2 мкмоль неорганического фосфата в пробе. В качестве восстановителя в этом методе используют систему эйконоген (а-1,2,4-аминонафтолсульфоновая кислота)-сульфит, кислотность 0,75 н. Реактивы: 1. (NH4) 2 Mo04—2,5%-ный раствор. 2. Н2S04—5 н. раствор. 3. Молибденовый реактив — смесь равных объемов молибденовокислого аммония (1) и серной кислоты (2). 4. Эйконоген (а-1,2,4-аминонафтолсульфиновая кислота). Очистка эйконоген а. В 1 л. дистиллированной воды, нагретой до 90° С, растворяют 15 г NаНSОз(Nа2 S205) и 10 г Nа2 S0з. Затем при постоянном помешивании растворяют 15 г эйконогена (температура раствора — 90° С) и фильтруют горячим через воронку с нагреванием. Фильтрат охлаждают, добавляют к нему 10 мл концентрированной НС1, перемешивают и фильтруют на воронке Бюхнера. Осадок промывают 300 мл охлажденной до 0°С дистиллированной воды, а затем спиртом. Промывают спиртом до тех пор, пока фильтр не станет бесцветным. Осадок высушивают на воздухе в темном месте. Хранят эйконоген в темной склянке. Основной раствор: 250 мг эйконогена, 15 г NаНSОз( или Nа2 S205) и 0,5 г Nа2 S0з растворяют в 100 мл воды. Рабочий раствор эйконогена: 1 объем основного раствора и 4 объема дистиллированной воды, хорошо перемешивают, если 34 необходимо фильтруют.-Раствор может храниться в темноте несколько дней. Очистку эконогена см. выше. 5. Стандартный раствор фосфата (КН2 РO4 ), содержащий 2 мкмоль фосфата в 1 мл. В качестве антисептика к раствору , добавляют 1—2 капли хлороформа. К раствору, содержащему от 0,2 до 2 мкмоль фосфата, добавляют дистиллированную воду до 2,5 мл и 1,5 мл молибденовой смеси; содержимое пробирок хорошо перемешивают. Затем во все пробы добавляют по 1 мл рабочего раствора эйконогена, все снова перемешивают и ставят в водяной термостат при 37°С на 10—15 мин или оставляют при комнатной температуре на 30—40 мин. После этого раствор •охлаждают и фотометрируют при 625 нм. Содержание фосфата в пробе рассчитывают по калибровочному трафику. Для построения графика проводят определение фосфора в стандартном растворе КН2Р04, беря различные его количества в пределах чувствительности данного метода, а именно от 0,2 до 2 мкмоль фосфата в пробе для колориметрирования (5 мл). Если в исследуемом растворе присутствуют лабильные фосфорные соединения, то поступают следующим образом. Определяют содержание фосфата в исходном безбелковом растворе айв том же растворе после осаждения из него неорганического фосфата магнезиальной смесью б {с. 38). По разности количества фосфата, найденного в пробах (а—б), рассчитывают количество неорганического фосфата в исследуемом растворе. МЕТОД ХЕРСА Метод Херса представляет собой модификацию метода Фиске— Суббароу. Благодаря небольшому снижению кислотности (0,25 н.) он позволяет определить неорганический фосфат в присутствии легко-гидролизуемых в кислой среде фосфорсодержащих соединений, таких, как АТФ, АДФ, глюкозо-1-фосфат, неорганический пирофосфат. Реактивы: см. определение неорганического фосфата методом Фиске—Суббароу (с. 34). К исследуемому раствору, содержащему 0,2—2 мкмоль фосфата, приливают дистиллированную воду до 4,3 мл, добавляют 0,5 мл молибденового реактива и 0,2 мл основного раствора эйконогена. Одновременно ставят контрольные пробы с дистиллированной водой (4,3 мл), которые обрабатывают, как указано выше. Содержимое всех пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем пробы тотчас же фотометрируют при 625—650 нм. При •более длительном времени выдерживания с молибденовым реактивом происходит гидролиз легкогидролизуемых фосфорных соединений. Содержание фосфата в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика берут несколько проб с различными количествами стандартного раствора (от 0,2 до 2 мкмоль фосфата), которые обрабатывают, как указано выше. МЕТОД САМНЕРА Метод позволяет определить от 0,05 до 0,5 мкмоль неорганического фосфата в пробе. В качестве восстановителя используется сульфат железа. Реактивы: 1. (NH4) 2 Mo04—б,6%-ный раствор. 2. Н2S04—7,5 н. раствор. 3. Раствор сульфата железа — 1 г Fe S04 *7Н20 растворяют в 10 мл Н2 О и добавляют 0,2 мл 7,5 н. раствора Н2S04. Раствор готовят непосредственно перед употреблением. 4. Стандартный раствор фосфата (КН2Р04,), содержащий 0,5 мкмоль фосфата в 1 мл. К исследуемому раствору, содержащему 0,05—0,5 мкмоль фосфата, приливают дистиллированную воду до 3,6 мл, добавляют 0,5 мл 6,6%-ного раствора молибдата аммония, 0,5 мл 7,5 н. раствора H2S04 и 0,4 мл раствора сульфата железа. Пробы перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 40 мин, после чего фотометрируют при 625 нм. Так же обрабатывают пробы стандартного ряда. МЕТОД РАТБУНА И ВЕТЛАХ Метод позволяет определить от 0,02 до 0,1 мкмоль неорганического фосфата в пробе. В качестве восстановителя используется хлористое олово. Проведение реакции в буферном растворе при рН 3,4 и введение в реакционную среду формальдегида позволяют определять неорганический фосфат в присутствии АТФ и веществ, имеющих сульф-гидрильные группы. Чтобы уменьшить возможность гидролиза лабильных фосфорных эфиров, рекомендуется добавлять в буферную среду этанол до конечной концентрации 10% в измеряемых пробах. Реактивы: 1. (NН4)2Мо04 — 2%-ный раствор. 2. Натрий-ацетатный буфер — 3 М раствор, рН 4,3, содержащий 3,7% формальдегида. 3. Хлористое олово — 6,75 мМ свежеприготовленный раствор (15 мг SnCL2 растворяют в 0,04—0,05 мл ледяной уксусной кислоты, объем раствора доводят водой до 10 мл). 4. Стандартный раствор фосфата (КН2Р04), содержащий 0,1 мкмоль фосфата в 1 мл. . К исследуемому раствору, содержащему 0,02—0,1 мкмоль неорганического фосфата, приливают дистиллированную воду до 1,6 мл, прибавляют 1,1 мл 3 М Nа-ацетатного буфера, рН 4,3, содержащего 3,7% формальдегида. К каждой пробе последовательно с интервалом 1—1,5 мин добавляют по 0,1 мл 2%-ного раствора молибдата аммония и сразу же после интенсивного перемешивания 0,2 мл 6,75 мМ раствора хлористого олова. Окраска развивается в течение 15 мин при 20° С. Пробы фотометрируют при 660 нм. При добавлении в буферную среду этанола окраска развивается до постоянных значений через 45 с. Так же обрабатывают пробы стандартного ряда. . Метод Ратбуна и Бетлах в модификации позволяет проводить определение неорганического фосфата в присутствии белка, если его содержание в измеряемых пробах не превышает 50 мкг. В этом случае к 1 мл исследуемого раствора прибавляют 1 мл 3 М Ма-ацетатного буфера, рН 4,3, содержащего 3% формальдегида. Затем добавляют по 0,1 мл 2%-ного раствора молибдата аммония и 0,1 мл 13,5 мМ раствора хлористого олова (15 мг SnCL2 растворяют в 4—5 каплях ледяной 36 СНзСООН и доводят объем'водой до 5 мл). Окраска развивается в течение 15 мин при 20° С, МЕТОД БЕНЦИНИ Метод позволяет определить от 0,02 до 0,16; 0,32 или 0,6 мкмоль неорганического фосфата в пробе в зависимости от прибора, используемого при фотометрировании. Основан на измерении интенсивности поглощения света при 350 нм комплексом, образованным фосфатом и молибдатом в присутствии двухвалентного иона цинка. Коэффициент молярного поглощения при 350 нм равен 7,2-103 М~1 см~1. Реакцию образования комплекса проводят при рН 5,0, что дает возможность определить неорганический фосфат в присутствии лабильных фосфорных соединений. Метод отличается быстротой выполнения. Реактивы (готовят на бидистиллированной воде): 1. НС1—6 н. раствор. 2. Молибденовый реактив — 15 мМ раствор (NН4)2Мо04, приготовленный на 100 мМ растворе ацетата цинка; рН полученного раствора доводят до 5,0 6 н. раствором НС1. Реактив хранят при комнатной температуре в защищенном от прямого солнечного света месте. 3. Стандартный раствор фосфата (КН2Р04). содержащий 0,4 мкмоль фосфата в 1 мл или 1 мкмоль фосфата в 1 мл. К раствору, содержащему от 0,02 до 0,16 мкмоль неорганического фосфата, приливают бидистиллированную воду до 0,4 мл, добавляют 1,2 мл молибденового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 1 мин. Фотометрируют на приборе «Спекол» при 350 нм в кюветах с расстоянием между рабочими гранями, равным 1 см (/=1 см). Содержание фосфата в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику, построенному с использованием стандартного раствора фосфата, содержащего 0,4 мкмоль в 1 мл. При работе на спектрофотометре (кювета: /==1 см, У=3 мл) объем фотометрируемых проб и содержание в них фосфата удваивают, оставляя без изменения соотношение объемов раствора фосфата и молибденового реактива, равное 1 : 3. В этом случае определяют до 0,32 мкмоль фосфата в пробе. При проведении определения на ФЭКе к раствору, содержащему от 0,05 до 0,6 мкмоль фосфата, приливают бидистиллированную воду до 0,6 мл, добавляют 1,8 мл молибденового реактива. Через 1 мин фотометрируют при 340 или 364 нм в кюветах с /=0,5 см. Для построения калибровочного графика используют стандартный раствор, содержащий 1 мкмоль фосфата в 1 мл. |
||
|
Чайник Пользователь Ранг: 33 |
16.02.2006 // 0:19:09
Ого как мне повезло! На блюдечке, все разжевано. Осталось проглотить! Работать мне… Скажите, Garry, а откуда эта информация? |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
