Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Как произвести очистку рекомбинантного белка от ДНК продуцентов и как ее валидировать >>>

  Ответов в этой теме: 2

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Как произвести очистку рекомбинантного белка от ДНК продуцентов и как ее валидировать
Nitrogen
Пользователь
Ранг: 3

10.07.2018 // 10:52:38     
Редактировано 2 раз(а)

Добрый день всем!
Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O . Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100).
Что лучше делать:
1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой.
2. Осадить полиэтиленимином
ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Methods:Polyethyleneimine_precipitation
3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE)
Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет. при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку.
4. Может как-то использовать центрипреп?
Как валидировать очистку?
Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное.
Буду благодарен за любую помощь.
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
Nitrogen
Пользователь
Ранг: 3


10.07.2018 // 15:30:41     
Редактировано 1 раз(а)

валидируют при помощи PCR, где то так: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28426392

Так же это изложено в USP, BP, EP.

Есть порог чувствительности метода, но даже если ПЦР не обнаруживает копий вектора, они все равно там присутствуют в подпороговом количистве. Более того, при промышленной очистке от ДНК, целые молекулы ДНК попадают в конечную фракцию белка. Поэтому, они будут медленно, но уверенно забивать колонку, особенно если колонка минипреапаративная, годная для аналитики. Логично, что без предколонки работать нельзя.
Или надо подбирать сорбент и буфер, чтобы высадить ДНК на самонабивной колонке на FPLC.

У кого какие соображения по этому поводу?
Nitrogen
Пользователь
Ранг: 3


11.07.2018 // 9:03:53     
В принципе, белка-то для иммунизации мышей требуются микрограммы, но это должен быть очень чистый белок - без обрезанных форм и агрегатов и белков клетки - хозяина. Поэтому можно пользоваться аналитической или минипрепаративной колонкой. Ведь в промышленных масштабах животных не иммунизируют. В промышленных масштабах могут чистить анитилела из гибридом. Сначала на минипрепаративе, а затем - масштабирование на промышленные колонки.

Наличие ДНК на иммунизацию мышей никак не влияет, это для человека рекомбинантные белки тестируют на наличие ДНК вектора или хозяина , во избежании потенциальных онкогенных эффектов. У мышек нужные иммунные клетки для получения гибридом появляются вне зависимости от наличия или отсутствия ДНК в рекомбинантном белке. Мышек не жалко

  Ответов в этой теме: 2

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты