Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 



ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Метод Бредфорда >>>

  Ответов в этой теме: 6

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Метод Бредфорда
meshkova
Пользователь
Ранг: 18

06.11.2018 // 10:04:52     
Есть тут люди освоившие метод Бредфорда?есть пара вопросов
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
optima
Пользователь
Ранг: 277


06.11.2018 // 10:06:48     
А что интересует? Когда-то занималась.
meshkova
Пользователь
Ранг: 18


06.11.2018 // 10:11:39     
Редактировано 1 раз(а)

снимаю спектр самого красителя (кумасси бриллиантовый синий), много шумов в нужной области
optima
Пользователь
Ранг: 277


06.11.2018 // 10:21:52     
Ну, спектр я не делала.
Мы его для определения концентрации белка использовали.
Делали калибровочную прямую по альбумину.
Сам раствор Бредфора фильтровали. До того растворяли долго на мешалке.
Там много веществ могут давать ложные результаты. Твины, например.
toxic1978
Пользователь
Ранг: 143


29.01.2019 // 12:26:10     
Редактировано 20 раз(а)

у меня есть опыт определения концентрации белковых веществ в пробе, методом Бретфорда. Правда, было это 15 лет назад - с тех пор работа в другом направлении.

Подтверждаю, реактив (раствор на основе фосфорной кислоты, кумасси R/G 250 и дистиллированной воды) перед использованием надо фильтровать через складчатый бумажный фильтр и обычную воронку, иногда даже 2-3 раза, используя каждый раз новый фильтр. Даже если визуально при первом осмотре взвесей нет. Первоначально, после растворения навески реактива, раствор будет темно-синий, почти черный. Готовый реактив после фильтрации должен быть прозрачный, светло-оливкового или коричневого цвета (субъективно), при смешивании с пробой, содержащей белковые вещества, образовывать раствор, имеющий ярко-синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка. Использовали растворы кумасси G250 и растворы R250 - смотря для чего.

У нас было так: сначала готовили концентрированный раствор кумасси по прописи, его и хранили, а раствор для анализа делали каждый раз перед работой, свежий, методом разбавления концентрированного водой, с фильтрацией. Но это уже может отличаться и является особенностью прописи Вашего метода. Важный нюанс следует уделить приготовлению раствора для градуировки, в нашем случае был обычный яичный альбумин (Сигма/Мерк). Сначала нужно в химический стакан набрать дистиллированную воду, затем аккуратно перенести в нее навеску альбумина, при этом частицы альбумина сразу останутся на поверхности раствора. Главное не перемешивать, стеклянные палочки не опускать, подождать минут 30 для гидратации молекул. Далее с ополосками раствор очень аккуратно переносят в мерную колбу и там доводят до метки, перемешивают методом перевертывания колбы с содержимым, избегая встряхивания - иначе будет пена белка. При ее образовании - ждать естественного оседания, готовый раствор белка не хранить. При наличии мути или опалесценции или ищут другой препарат белка или фильтруют, но затем это учитывают в выводах. При проведении анализа по методу Бретфорда избегают энергичности, т.е. холерики гуляют лесом.

В работе следят за кюветами, пипетками и вообще любой посудой (мы использовали кварцевые, расстояние между гранями 5 мм). Важна их чистота. Для ее соблюдения использовали многократную промывку, хромпик (не уверен уже, но кажется кислоты хорошо отмывали остатки кумасси и тогда он был еще разрешен), сушку в темошкафу (кроме кювет). Все штативы - идеальный чистый пластик и металл. Проверяйте кюветы - должны быть и чистыми и без погрешности более 0,005 ед. абсорбции, при их промывке исключить всё щелочное.

Мы спектр комплекса белка и кумасси по всем длинам волн не снимали, но и калибровка и результаты по одной длине волны, оговоренной в методике, были удовлетворительные всегда (видимая часть спектра, район 650 нм, кажется). Главное анализ, градуировку и выводы делать на одной порции отфильтрованного реактива кумасси. Это ноу-хау этого метода, о котором редко пишут в книгах, в том числе у Бейли. Ну плюс чтобы сама проба перед анализом и ее аликвота, но уже с краской, тоже были прозрачными. Это важно. Если проба мутная, используйте ее фугат и ОДНОРАЗОВЫЕ пробирки эппедорф, из пластика.

Про вещества, которые могут искажать результаты анализа - отдельная тема, и это уже выходит за рамки этой короткой познавательной беседы.

Надеюсь, помог
Lipids
Пользователь
Ранг: 385


31.01.2019 // 3:52:23     

toxic1978 пишет:
у меня есть опыт определения концентрации белковых веществ в пробе, методом Бретфорда. Правда, было это 15 лет назад - с тех пор работа в другом направлении.

Подтверждаю, реактив (раствор на основе фосфорной кислоты, кумасси R/G 250 и дистиллированной воды) перед использованием надо фильтровать через складчатый бумажный фильтр и обычную воронку, иногда даже 2-3 раза, используя каждый раз новый фильтр. Даже если визуально при первом осмотре взвесей нет. Первоначально, после растворения навески реактива, раствор будет темно-синий, почти черный. Готовый реактив после фильтрации должен быть прозрачный, светло-оливкового или коричневого цвета (субъективно), при смешивании с пробой, содержащей белковые вещества, образовывать раствор, имеющий ярко-синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка. Использовали растворы кумасси G250 и растворы R250 - смотря для чего.

У нас было так: сначала готовили концентрированный раствор кумасси по прописи, его и хранили, а раствор для анализа делали каждый раз перед работой, свежий, методом разбавления концентрированного водой, с фильтрацией. Но это уже может отличаться и является особенностью прописи Вашего метода. Важный нюанс следует уделить приготовлению раствора для градуировки, в нашем случае был обычный яичный альбумин (Сигма/Мерк). Сначала нужно в химический стакан набрать дистиллированную воду, затем аккуратно перенести в нее навеску альбумина, при этом частицы альбумина сразу останутся на поверхности раствора. Главное не перемешивать, стеклянные палочки не опускать, подождать минут 30 для гидратации молекул. Далее с ополосками раствор очень аккуратно переносят в мерную колбу и там доводят до метки, перемешивают методом перевертывания колбы с содержимым, избегая встряхивания - иначе будет пена белка. При ее образовании - ждать естественного оседания, готовый раствор белка не хранить. При наличии мути или опалесценции или ищут другой препарат белка или фильтруют, но затем это учитывают в выводах. При проведении анализа по методу Бретфорда избегают энергичности, т.е. холерики гуляют лесом.

В работе следят за кюветами, пипетками и вообще любой посудой (мы использовали кварцевые, расстояние между гранями 5 мм). Важна их чистота. Для ее соблюдения использовали многократную промывку, хромпик (не уверен уже, но кажется кислоты хорошо отмывали остатки кумасси и тогда он был еще разрешен), сушку в темошкафу (кроме кювет). Все штативы - идеальный чистый пластик и металл. Проверяйте кюветы - должны быть и чистыми и без погрешности более 0,005 ед. абсорбции, при их промывке исключить всё щелочное.

Мы спектр комплекса белка и кумасси по всем длинам волн не снимали, но и калибровка и результаты по одной длине волны, оговоренной в методике, были удовлетворительные всегда (видимая часть спектра, район 650 нм, кажется). Главное анализ, градуировку и выводы делать на одной порции отфильтрованного реактива кумасси. Это ноу-хау этого метода, о котором редко пишут в книгах, в том числе у Бейли. Ну плюс чтобы сама проба перед анализом и ее аликвота, но уже с краской, тоже были прозрачными. Это важно. Если проба мутная, используйте ее фугат и ОДНОРАЗОВЫЕ пробирки эппедорф, из пластика.

Про вещества, которые могут искажать результаты анализа - отдельная тема, и это уже выходит за рамки этой короткой познавательной беседы.

Надеюсь, помог

Спасибо большое. У нас помню была целая эпопея с ложно позитивной реакцией кумасси на глимы, а в литературе нигде этого не видели…
Реклама на ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
Размещение рекламы
ФР.1.31.2006.02410  «Методика выполнения измерений массовых концентраций нефтепродуктов и жиров (при их совместном присутствии) в пробах питьевых, природных и очищенных сточных вод методом ИК-спектрофотометрии» ФР.1.31.2006.02410 «Методика выполнения измерений массовых концентраций нефтепродуктов и жиров (при их совместном присутствии) в пробах питьевых, природных и очищенных сточных вод методом ИК-спектрофотометрии»
Диапазон измеряемых концентраций составляет: для нефтепродуктов - от 0,04 до 5,00 мг/дм3, для жиров - от 0,1 до 10,0 мг/дм3.
[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]
toxic1978
Пользователь
Ранг: 143


31.01.2019 // 15:32:09     
Редактировано 1 раз(а)

Ну. В таком случае, скажу так. При определении того, что и на сколько может искажать результат анализа с использованием этого реактива, следует исходить из состава самой пробы и проверять величину аналитического сигнала по отношению каждого из компонентов по отдельности, на модельных растворах чистых веществ, в среде, близкой по условиям к анализируемой.

При проведении реакции важны не только буферные характеристики среды, но и соотношение объемов проба/краска.

  Ответов в этой теме: 6

Ответ на тему



ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]

ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2009
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты