| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Как отмыть колонку Agilent ZORBAX Eclipse AAA от фосфатного буфера >>>
|
 |
| Автор | Тема: Как отмыть колонку Agilent ZORBAX Eclipse AAA от фосфатного буфера | ||
|
Vilkaceraptor Пользователь Ранг: 10 |
 16.02.2019 // 23:31:51
Всем добра коллеги. Суть проблемы - начал ставить метод на аминокислоты, ВЭЖХ Agilent 1200, колонка Agilent ZORBAX Eclipse AAA 75 х 4.6 мм. Не мудрствуя решил сделать, как написано в буклетике к колонке, посчитав, что инженеры Agilentа должны быть не глупыми людьми. Программу вкола и всё остальное также по буклетику. Три дня все было, как по учебнику стабильно, красивые пики, но затем все пошло наперекосяк, давление подскочило вплоть до автоматической остановки хроматографа. Промыл всё, что мог, поменял фильтр на насосе, вроде , как стабилизировал систему. Но теперь при вколе того же стандарта аминокислот пики на FLD детекторе стали значительно меньше. Есть подозрение, что в колонке фосфатный буфер выпал в осадок. Как промыть колонку? Колонка была новой. Еще обратил внимание, что в разных методиках Agilentа разные концентрации фосфатного буфера. Mobile Phase A: 40 mM Na2HPO4 pH 7.8 [5.5 g NaH2PO4, monohydrate + 1 liter water, djust to pH 7.8 with NaOH solution (10 N)] -- Вот тут меня смущает почему у них вне скобок гидрофосфат натрия, а в скобках дигидрофосфат? Формулу набирал не вручную, откопипастил с официального буклета. У меня в бумажной версии тоже самое написано. А это та же фаза на теже аминокислоты но с другого Agilent-ского буклета Mobile phase A: 10 mM Na2HPO4: 10 mM Na2B4O7, pH 8.2: 5 mM NaN3 For 1 liter: (1.4 g anhydrous Na2HPO4 + 3.8 g Na2B4O7·10H2O in 1 L water + 32 mg NaN3). Какой из них правильный? Думаю перейти на другой буфер например ацетатный, но в разных источниках включая Agilent разные рецепты его приготовления. Подскажите пожалуйста. |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
SergeyK Пользователь Ранг: 2168 |
17.02.2019 // 9:46:59
Рискну предположить, что эти три дня вы пробы кололи, а не чистые градуировочные растворы. И забили колонку они, а не буфер. Смывается буфер водой или 0.5 % фосфорной с 20% ацетонитрила в изократическом режиме, 20 объемов колонки прокачать. Рекомендую готовить буфер из осч раствора щелочи и концентрированной кислоты. Отечественные фосфаты очень грязные, несмотря на паспорт. Буфер молярный по фосфату, не знаю почему вас удивляют разные навески по-разному замещенных солей. Правильный буфер любой, который работает в вашей задаче. Смотрите внимательно, в agilent aminoquant много фаз используется, hypersil aa, ваша, xdb-c18, eclipse plus c18, буфер свой для каждой, не перепутайте. Фосфатный нейтральный буфер быстро цветет, готовьте свежий или консервируйте азидом, храните в холоде, регулярно перефильтровывайте. |
||
|
Vilkaceraptor Пользователь Ранг: 10 |
17.02.2019 // 11:17:55
Добрый день! Спасибо за ответ. Действительно, после постановки градуировочных графиков я вкалывал пару проб, для того, чтобы понять работает или нет методика. Одна проба была ячмень, вторая кобылье молоко. Гидролиз образцов проводил классическим методом с 6М HCl при 105С в запаиваемых ампулах с продувкой азотом. Далее выпаривание на роторнике и разбавление бидистилятом. Если, как Вы говорите колонку забили образцы, то, как быть в этом случае? Чем промывать? |
||
|
SergeyK Пользователь Ранг: 2168 |
17.02.2019 // 12:19:05
Редактировано 1 раз(а) Я на hypersil ods aa отмывался противотоком ацетонитрил-вода 50:50, потом дмсо (аптечный димексид), потом опять ацетонитрил-вода, потом ацетонитрил. Разводите буфером пробы после гидролиза 2-100 раз, чтобы всё, что может выпасть, выпало в пробирке, а не в колонке, потом фильтруйте или центрифугируйте, потом колите. Используйте предколонку. |
||
|
vmu Пользователь Ранг: 1237 |
17.02.2019 // 12:38:03
"40 mM Na2HPO4 pH 7.8" - упрощенное, но близкое к реальности обозначение состава раствора. 5.5 г моногидрата дигидрофосфата натрия на 1 л раствора - это 40 мМ дигидрофосфата. При добавлении щелочи до pH 7.8 получается раствор, содержащий те же 40 мМ фосфатов, из которых около 80% будет в виде моногидрофосфата, а остальные 20% - в виде дигидрофосфата. |
||
|
Vilkaceraptor Пользователь Ранг: 10 |
17.02.2019 // 14:09:52
Редактировано 1 раз(а) SergeyK, vmu Спасибо за советы и пояснение. В понедельник попробую ваши рекомендации. Еще вопрос остался, стоит ли переходить на ацетатный буфер? Все таки он не такой противный, как фосфатный. И если да, посоветуйте рабочий рецепт? И что лучше подойдет ацетат натрия или амония? Да и еще, вот во всех методиках пишут доводить рН до 7,8 нужного щелочью, так у меня изначально раствор получается где то 9,2, довожу фосфорной кислотой. Еще раз спасибо коллеги. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
vmu Пользователь Ранг: 1237 |
17.02.2019 // 14:57:39
Редактировано 2 раз(а) Если при растворении NaH2PO4·H2O вы получаете pH 9.2, то вы растворяете не NaH2PO4·H2O, а что-то другое (например, буру), или растворяете не в воде, а уже в каком-то щелочном растворе. Производитель колонок уже посоветовал вам рабочие рецепты. Из ацетата натрия или аммония не приготовить буферный раствор с pH 7.8. |
||
|
SergeyK Пользователь Ранг: 2168 |
17.02.2019 // 15:12:11
Если у вас хроматограф тоже аджилент, то клапан на активный ещё неплохо бы поменять. Если не слышали про такое, поищите Active Inlet Valve Agilent. И промывку плунжера иметь (Agilent Seal Wash). |
||
|
Vilkaceraptor Пользователь Ранг: 10 |
17.02.2019 // 16:15:54
Редактировано 2 раз(а) Я готовлю буфер из Na2НPO4·12H2O из расчета 40 mM, растворяю дис водой с рН 5,3-5,4, рН-метр калибрую сам раз в неделю. Поэтому точно ни в каком щелочном растворе я не готовлю свой буфер. Всё что Вы описали у меня стоит. Если все таки остается вариант работать с фосфатным буфером, можете посоветовать, как правильно промывать после анализа? Я обычно после анализа промываю Бидистелятом 10 объемов, потом Ацетонитрилом столько же и опять Бидистелятом. Мне говорили, что если фосфатный буфер промывать сразу Ацетонитрилом, то сразу выпадает осадок. |
||
|
vmu Пользователь Ранг: 1237 |
17.02.2019 // 16:42:50
Редактировано 1 раз(а) Вот именно, вы берете Na2НPO4, а не указанный в методике NaH2PO4, потому и получаете слишком щелочной pH, который приходится доводить до pH 7.8 кислотой, а не щелочью. При этом навеску соли вы рассчитываете на концентрацию 40 мМ, но при доведении фосфорной кислотой у вас уже получится больше 40 мМ фосфатов в растворе в отличие от приготовления по методике. На хроматографии это может и не отразиться, а может и заметно повлиять. Сразу чистым ацетонитрилом, пока не вымыли из колонки соли, промывать, конечно, не надо. Обычное правило: промыть элюентом с тем же соотношением вода/растворитель, что и в ПФ, но без солей/кислот/оснований. Затем можно промыть более сильной водно-органической смесью вплоть до 100% ацетонитрила. Затем возвращаете на водно-органическую смесь. Можно оставить колонку на хранение и в чистом ацетонитриле, но тогда перед началом работы и подачей в нее ПФ с солями колонку надо промыть водно-органическим элюентом. |
||
|
SergeyK Пользователь Ранг: 2168 |
17.02.2019 // 21:40:26
vmu вам все верно пишет. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 40
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
