Анализ биожидкостей >>>

Ответов в этой теме: 12   Страница: 1 2   «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

18.02.2007 // 22:46:53     

---

---

Slawa пишет:
Здравствуйте!
Поставлена задача: определить концентрацию антибиотика в сыворотке крови методом ВЭЖХ. Уровень концентрации составляет порядка 1-5 мкг/мл, связывание с белками 70-80%.
Чтобы не усложнять себе существование я в случаях необходимости анализа лекарств в кровях поступаю просто: беру кровь, отстаиваю при комнатной температуре , центрифугирую при 3000 об/мин 15 мин, отбрасываю тромб и получаю сыворотку. Беру 1 мл сыворотки, приливаю три мл ацетонитрила (соотношение соблюдать точно!) -- выпадают белки, центрифугирую 15 мин при 3000 об/мин (чем больше оборотов -- тем лучше). Полученный раствор обезжириваю гексаном, фильтрую и колю в хроматограф.
Тут может быть облом -- некоторые фильтры сажают на себе определяемые вещества -- количественно сажают. Жирорастворимое лучше не фильтровать через тефлоновые фильтры, а соли металлов -- через целлюлозу.
По опыту знаю -- теоретически подобрать фазу нереально. Обычно я начинаю с Зорбакс XDB С-6, не помогает -- перехожу к XDB С-18, затем BDS С-18. Как подвижную фазу люблю использовать гептансульфокислоты натриевую соль с С=10 Ммоль/л (можно больше -- но это дорогое удовольствие) в воде с добавлением 1,0-2,0 мл фосфорной кислоты на 1 л.
Мне нарвится эта система -- не нужно устанавливать рН, но подходит и обычный фосфатный буфер.
Органическая фаза -- ацетонитрил сорта О. Беру 10% водной фазы и ищу колонку, на которой стандарт будет выстреливать сразу после реакции системы на ввод. Иногда пик совпадает с этой самой реакцией -- в таком случае после подачи стандарта кран не закрываю, а подаю элюэнт через петлю.
Принцип метода в том, что среда крови -- щелочная, щелочные вещества здорово зависают на колонке с кислотным элюентом. После того, как выскочило определяемое вещество даю градиент, увеличивая ацетонитрил до 90% примерно за 30 мин и иду пить пиво -- пиков будет много. Очень много. На новой колонке удается разглядеть при 200 нм до 180 пиков, отрицательные пики тоже не должны смущать.Потом пиков становится все меньше и меньше -- после 200 анализов может быть вообще 2 пика -- определяемого вещества и все остальное. Еще 10 мин отмываю чистым ацетонитрилом.
Иногда метод не работает по причине низкой концентрации определяемого вещества -- тогда пытаюсь колоть его в ГЖХ. Не помогает -- варю в трифторуксусном ангидриде и еще раз колю, не летит -- пытаюсь получить ТМС производные и колю в последний раз. Потом иду к заказчику и говорю "извиняй, братан, не получилось". Еслми заказчик настаивает на проведении исследования, звоню в местную фирму, поставляющую патроны для ТФЭ (стоят 3-4 бакса за 1 шт, заказываю 200 шт). Заодно прошу колонку в счет ввернуть (еще штука, полторы зеленых). Беру счет и несу к заказчику -- не было в моей практике случая, что бы ко мне еще раз после этого пытались приставать.