| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
LC-MS: MRM, MSM? >>>
|
 |
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
zinj Пользователь Ранг: 19 |
 21.03.2007 // 15:15:21
Еще раз прошу прощения, если мои вопросы кажутся неграмотными. Если я правильно понимаю, режимы Scan, SIM (selected ion monitoring) и TIC (total ion current) используются в масс-спектрометрии для детекции целых ионов аналита. Тогда как режимы MRM (multiple reaction monitoring)и SRM (selected reaction monitoring) - для детекции уникальных фрагментов. Исходя из этого, у меня возникает вопрос: возможно ли количественное определение стероидных гормонов (кортизол, прогестерон, тестостерон) в сыворотке крови методом LC-MS в режиме SIM при использовании дейтерированных внутренних стандартов? Хватит ли чувствительности метода при использовании SIM-режима? Чувствительность метода должна быть меньше: 5 нмоль/л для кортизола 0,5 нмоль/л для прогестерона 0,2 нмоль/л для тестостерона Спасибо. |
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
21.03.2007 // 18:51:35
TIC (total ion current) это метод отображения хроматограммы. Как таковой, он не детектирует ничего специфически - ну, как народный акын из анекдота - "чего вижу, о том пою", а о чем петь ему без разницы. Видит правильный ион - хорошо, видит грязь - и это покатит "тогда как режимы MRM (multiple reaction monitoring)и SRM (selected reaction monitoring) - для детекции уникальных фрагментов". Да, но добавлю - из уникальных precursor(s). Т.е. вы ему должны сказать, какую массу / массы долбить в collision cell (ну или в trap, чего есть) |
||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
22.03.2007 // 0:15:01
Да уж, Вам не позавидуешь. 0,2 нмоль/л для тестостерона это порядка 50 пг/мл, а эти стероидные гормоны весьма плохо ионизируются. Задача совершенно не для начинающего. Вы хоть литературу-то посмотрели? (не на русском, конечно!) Для начала, было бы неплохо представлять какими источниками Вы располагаете (ESI, APCI, APPI ?). Далее, не пойму, чего Вам дался SIM режим. Если я не ошибаюсь, у Вас тройной квадруполь. Комечно, без фрагментации абсолютный сигнал будет выше, но и нулевая и шумы тоже, да и матрица даст свой вклад в виде изобарических примесей. Такие вещи, если прибор позволяет, всегда делают в MRM. В этом случае можно получить приличное отношение сигнал/шум и хорошо отделиться от всех мешающих ионов. Дейтерированные внутренние стандарты этому не помеха, при условии, что примесь недейтерированного вещества невелика. Чаще всего, так оно и есть, по крайней мере, в 95% случаев. Еще раз советую посмотреть статьи, опубликованные в научных журналах по этой теме (к счастью, публикаций много!). Посмотрите, проанализируйте, выберите стратегию пробоподготовки, и я с удовольствием обсужу с Вами эту тему более конкретно. Не советую пытаться делать "в лоб" без анализа литературы. Могу заверить, набъете много шишек и потеряете много времени. Что же касается общего ответа на поставленный вопрос, то да, в принципе возможно. Но к решению этой задачи есть несколько подходов, зависящих от Вашего оборудования (о коем у меня только смутное представление). |
||
|
Spectrometrist Пользователь Ранг: 777 |
22.03.2007 // 2:00:24
Islander, а что, этот FAIMS от Thermo как там их сейчас, действительно такакя революционная штука? Они ведь на triple quad его предлагают навьючивать, так? |
||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
22.03.2007 // 2:12:37
Я разговаривал с первыми пользователями и разработчиками этого устройства задолго до того, как Thermo их скупила на корню. Пытался получить образец для испытаний у нас, но не вышло. По тому что слышал и видел, вещь полезная. Но дорогая. И, конечно, не панацея от всех бед. Без головы на плечах все равно не поможет... В отдельных случаях может позволить сэкономить время и решать задачу "в лоб" без необходимости поиска оригинальных обходных путей. |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
zinj Пользователь Ранг: 19 |
22.03.2007 // 9:58:40
Редактировано 3 раз(а) Совершенно верно, 57,684 пг/мл. Судя по литературным данным, нижняя граница чувствительности API-4000 по стероидам - 10 пг/мл. У LCMS-2010 данных по стероидам не нашел, написано, что тоже высокая чувствительность  Да, анализ литературы провел. А на русском вообще есть что-то подобное? Есть возможность использовать любой из перечисленных источников, но т.к. стероиды - низко-полярные соединения, естественно предпочтительней будет использовать фотоионизацию при атмосферном давлении. Абсолютно согласен, что во всех статьях по этой теме указывается MRM-режим. SIM-режим мне дался лишь потому, что у LCMS-2010 есть только три режима: Scan, SIM, и, названный вами сленговым, MSM-режим. Конечно, было бы проще, не мудрить, а использовать для этих целей API-3000, но фирма занимающаяся продажей LCMS-2010 любезно предложила опробовать нашу методику в своей стендовой лаборатории, территориальное расположение которой подкупает своей близостью. Возможностей апробации методики на API-3000/4000 в Питере я, к сожалению, не нашел. Стратегия пробоподготовки такова (по данным литературы): Реагентика: 1. Аналиты 2. Дейтерированные внутренние стандарты 3. Bio-Rad контроли 4. Метанол (Optima grade, ОСЧ) 5. БСА (96%) 6. Ацетонитрил (Optima grade, ОСЧ) 7. Вода для ВЭЖХ 8. Аммония ацетат 9. Толуол (Optima grade, ОСЧ) Аналиты: a. Кортизол (4-pregnen-6β, 11β, 21-triol-3, 20-dione) Молекулярная масса: 362.46 b. Прогестерон (4-pregnen-3, 20-dione) Молекулярная масса: 314.46 c. Тестостерон (4-androsten-17β-ol-3-one) Молекулярная масса: 288.42 d. Дегидроэпиандростерон-сульфат (5-androsten-3β-ol-17-one sulphate, sodium salt) Молекулярная масса: 390.47 Стоковые растворы аналитов с концентрацией 1 мг/мл готовятся в метаноле и хранятся при -20°С. Промежуточные стоки аналитов в метаноле: 1. Кортизол - 68.1 мкг/мл 2. Прогестерон - 3.31 мкг/мл 3. Тестостерон - 2.09 мкг/мл 4. Дегидроэпиандростерон-сульфат - 469.4 мкг/мл Калибровочные пробы (КП) готовятся путем разведения промежуточного стока аналита 4% водным раствором БСА в 10, 20, 100, 200, 500, 1000 раз. Седьмая КП – blank (раствор БСА). КП необходимы для построения калибровочной кривой (КК) с клинически значимым диапазоном концентраций для каждого аналита. Внутренние стандарты, меченные дейтерием: a. Кортизол-9,11,12,12-d4 (cortisol-9,11,12,12-d4) b. Прогестерон-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d9 (progesterone-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d9) c. Тестостерон-1,2-d2 (testosterone-1,2-d2) d. В качестве внутреннего стандарта для дегидроэпиандростерон-сульфата используется тестостерон-1,2-d2 Растворы внутренних стандартов с концентрацией 80 нг/мл готовятся в ацетонитриле. Внутренние стандарты необходимы также для преципитации белков в КП или сыворотке. Приготовление пробы В 2 миллилитровую, коническую, пластиковую, центрифужную пробирку добавляется 760 мкл КП или сыворотки и 1140 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле. Пробирка закрывается, откручивается на вортексе в течение 30 с и центрифугируется 10 мин при 13 000 g. Супернатант объемом 1700 мкл помещается в емкость автосамплера LC-MS для инъекции в хроматографическую колонку. Пробоподготовка происходит при комнатной температуре. |
||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
23.03.2007 // 2:02:09
Ну, на заборе и не то бывает написано... Начну с того, что Вы пытаетесь сравнить приборы совершенно разных классов. API-4000 - тройной квадруполь, один из лучших на рынке, а LCMS-2010 - ширпотребный простой квадруполь, потому в нем и нет MRM-режима. Продавцы могут Вам и не такой лапши на уши навешать. Лично я на LCMS-2010 за Вашу задачу просто не взялся бы, хотя никогда и не пробовал на нем работать. Если не верите моему чутью, можете попытаться. На API-4000 Ваша задача точно решаема, хотя попотеть придется, особенно с хроматографией. Она, скорее всего, решаема и на API-3000, но не со столь простой пробоподготовкой. Сразу видно, что с литературой Вы работали, и это прекрасно! Хотя должен отметить, что если для недериватизированных нейтральных стероидов лучше всего использовать именно APPI с положительной ионизацией, то Дегидроэпиандростерон-сульфат даст лучший отклик на ESI с отрицательной ионизацией. Скорее всего он даст приемлемый сигнал и на APPI, ибо его много, но не исключено, что придется переключать полярность. Есть также еще один подход, который даст максимальную чувствительность - ESI со специфической дериватизацией то кетогруппе (полагаю, Вы это тоже видели в литературе). Этот вариант даст достаточный сигнал даже на API-3000, но заведомо сложнее как в плане пробоподготовки, так и хроматографически. Главная проблема при работе с биологическим образцами при таких чувствительностях - посторонние пики из матрицы. Не исключено, что чувствительности на стандартах Вам хватит и в SIM. Но эти пики Вам забъют весь полезный сигнал, как только Вы станете работать с сывороткой. Фрагментирование с последующей масс-спектроскопической фильтрацией дочерних ионов (MRM) позволяет выделить только те ионы, которые разваливаются на правильные фрагменты, что резко улучшает картину. Хотя у интересующих Вас веществ полно эндогенных изомеров, так что без хорошей хроматографии Вам не обойтись.
Тут еще одна большая пакость. Если бы у Вас были только нейтральные стероиды, можно было бы упростить хроматографию, сделав ее в нормальной фазе и добавив толуол прямо в ПФ. А так, если Вы хотите получить все в одном заколе, Вы обречены на градиент в обращенке, ибо Дегидроэпиандростерон-сульфат гораздо полярнее всего остального. Учитывая сказанное, выбор внутреннего стандарта для него совершенно неподходящий, тем более что ионизация в APPI весьма подвержена матричному подавлению. Ищите какой-нибудь близкий по структуре неэндогенный стероидный сульфат (задача может оказаться нетривиальной).
Такой подход к пробоподготовке наиболее прост, но и дает, с одной стороны, весьма грязный экстракт, таящий в себе много сюрпризов, как в виде интерферирующих пиков, так и в плане влияния на ионизацию. С другой стороны, неизбежно 3-х кратное разбавление пробы, требующее более высокой чувствительности прибора. Однозначно, это только API-4000 под силу. Использование ТФЭ со смешанным обращенно-фазным/анионообменным механизмом (Oasis MAX, Waters) может позволить вместо разбавления образец сконцентрировать, а при необходимости, отделить фракцию с нейтральными стероидами от фракции с Дегидроэпиандростерон-сульфатом. Учитывая большую разницу в хроматографических и масс-спектрометрических свойствах, раздельный анализ может оказаться более удобным. Мне кажется, что с концентрированием раза в 2.5-5 вам может хватить чувствительности и на API-3000. |
||
|
zinj Пользователь Ранг: 19 |
23.03.2007 // 14:44:38
Уважамый Islander, огромное спасибо за советы! Они бесценны, но честно признаюсь, иногда моего медицинского образования бывает недостаточно, чтобы понять их Хочу разобраться в определениях, возможно, мы с Вами говорим о разных вещах. По литературным данным, LoQ – limit of quantitation (предел количественного определения) API-3000 для тестостерона, например, составляет 0,347-0,69 нмоль/л или 100-199 пг/мл (по разным работам). Говоря о требуемой чувствительности для тестостерона - 0,2 нмоль/л или 57,684 пг/мл, я имел в виду LoD – limit of detection (предел обнаружения). Исходя из этого, не могли бы Вы предположить значения LoD по стероидам для API-3000 (MRM-режим) и LCMS-2010 (SIM-режим), а также значения LoQ по стероидам для LCMS-2010 (SIM-режим)?
Да, я понимаю, что LCMS-2010 даже не тандемный масс-спектрометр 
Хроматография планируется следующая: автосамплер (Shimadzu SIL-HT) при комнатной температуре впрыскивает аликвоты в хроматографическую колонку (Supelco LC-18-DB, 3.3 cm x 3.0 mm, 3.0-mm внутренний диаметр), оснащенную защитной колонкой (Supelco Discovery C-18, 3.0 mm) с идентичным наполнителем (Supelco, St Louis, Mo). Стероиды оседают на колонке, которая промывается р-ром С (смесь, содержащая 15 мМ р-р аммония ацетата и вода-метанол (объемные доли 98:2, pH 5.5) со скоростью 1 мл/мин. После 5 минут промывки срабатывает редуктор и колонка элюируется градиентом р-ров А (вода-метанол, объемные доли 98:2) и B (метанол) со скоростью 0,5 мл/мин (A/B: 100/0 – 5 мин, 50/50 – 7 мин, 45/55 – 11 мин, 40/60 – 14,5 мин, 20/80 – 17,9 мин, 100/0 – 18 мин). Затем образец поступает в масс-спектрометр. Перед следующим впрыском колонка промывается 100% р-ром B в течение 4 минут. В том-то и дело, что одна из поставленных передо мной задач - максимально упростить процесс пробоподготовки. Описанная мной выше методика хроматографии подойдет? Нет, планируется проводить отделный анализ на каждый из перечисленных стероидных гормонов. Определение стероидного профиля не требуется. |
||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
24.03.2007 // 18:18:49
Редактировано 2 раз(а) Во-первых, я вообще не понимаю практического смысла задавать LOD в требованиях к методике. От нас заказчики требуют конкретного LOQ, а уж какой при этом получится LOD - никого не волнует. Теперь перейдем к определениям: под LOD обычно понимается концентрация, дающая отношение сигнал/шум не хуже 3-х. По требованиям FDA ( ) в биоаналитических методах под LOQ понимается концентрация, определяемая с воспроизводимостью не хуже 20%, что, теоретически, соответствует отношению сигнал/шум не хуже 5-и. Таким образом, принципиально это мало что меняет. Пользуясь Вашим же литературным анализом, можно убедиться, что API-3000, скорее всего, не подойдет для анализа тестостерона с требуемым LOD. Впрочем, к литературным данным надо уметь относиться критически. Многое зависит, во-первых, от пробоподготовки (степень очистки от мешающих веществ и степень концентрирования) и, во-вторых, от индивидуального прибора (разброс чувствительности между приборами, только-только проходящими спецификации, каких больше половины, и лучшими образцами, каких единицы, может запросто достигать порядка). Немаловажны и субъективные факторы, как квалификация аналитика, проводящего пробоподготовку и, особенно, масс-спектрометриста, оптимизирующего отклик на приборе. С Вашим подходом - иметь минимум пробоподготовки, да еще с разбавлением, Вы обречены работать на самых дорогих приборах (API-4000, API-5000). Это характерно в целом для отрасли, где менеджеры предпочитают вкладывать деньги в новые более дорогие приборы, нежели в разработку методик. Ибо найти высококлассного специалиста трудно, да и времени на сложную разработку нужно много. У нас ситуция другая, на 12 приборов API-3000 всего лишь 3 API-4000, поэтому приходится думать. Ну а про LCMS-2010 все, что хотел, я уже сказал. Просто сравните цены и решите, случайна ли такая разница (учитывая также количество проданных приборов по всему миру).
Я смотрю, у Вас нет требования иметь высокую производительность. Это хорошо, позволяет уменьшить требования к пробоподготовке. С нашими 2-3 минутами на закол так не развернешься. То что Вы привели, весьма универсальный подход, и, скорее всего, подойдет для анализа всех аналитов в одном флаконе. Но если у Вас нет такого требования, то можно оптимизировать хроматографию для каждого вещества в отдельности и добиться существенного сокращения времени анализа. Но это надо делать непосредственно на приборе, обращая внимание не только на видимые посторонние пики, но и на подавление ионизации от невидимых компонентов матрицы. Кстати, проверка на матричные эффекты нужна в любом случае. Интересно, на какую производительность по анализам Вы ориентируетесь?
Удел богатых, но ленивых.
Возможно. Заочно это не сказать. Надо проверять на наличие посторонних пиков и матричные эффекты. Кстати, имейте ввиду, что состав элюента также имеет огромное влияние на эффективность ионизации и, следовательно, чувствительность. Небольшие добавки летучих солей и кислот, правильный выбор растворителей могут запросто изменить сигнал на порядок, а то и больше. То же касается и скорости потока. Все это, вместе с параметрами источника и масс-спектрометра требует тщательной и длительной оптимизации.
Так может все-таки воспользоваться ТФЭ, по крайней мере, для тестостерона, - шансы получить достаточную чувствительность на API-3000 резко увеличатся. |
||
|
zinj Пользователь Ранг: 19 |
27.03.2007 // 12:05:39
Предполагаемая производительность: 200 образцов сывороток на 1 из вышеперечисленных аналитов с частотой постановки анализа - 1-2 раза в месяц. |
| |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
