| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
проблемы с дериватизацией катехоламинов >>>
|
 |
| Автор | Тема: проблемы с дериватизацией катехоламинов | |||||
|
Марианна Пользователь Ранг: 21 |
 01.07.2008 // 14:09:44
Здравствуйте. Определяем катехоламины на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором. Воспользовались статьей Yoshitake et all. Они проводят дериватизацию серотонина, норадреналина и дофамина бензиламином в CAPS-буфере (pH 10) в присутствии гескацианоферрата калия. Мы в точности вопроизвели все условия указанные в статье, но результата не получили. Похоже, что не идет реакция. Возможно, необходимы какие-то особые условия (не указанные в статье). Будем благодарны за совет. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Dezh Пользователь Ранг: 157 |
01.07.2008 // 14:13:04
А поподробнее можно по реакции, как серотонин, например, модифицируется бензиламином - очень интересно! |
|||||
|
LVK Пользователь Ранг: 37 |
01.07.2008 // 15:58:54
Открываем клуб жертв Yoshitake  Реакция-то идёт (у нас дериватизация двойная, по другой их статье, но серотонин с одним бензиламином пробовали). Но чувствительность - по крайней мере с нашим детектором, Agilent G1321A - на 2 порядка ниже, чем у них изображено на графиках.
|
|||||
|
Dezh Пользователь Ранг: 157 |
01.07.2008 // 16:11:59
И все-таки интересно... Формулу конъюгата можете привести? |
|||||
|
Марианна Пользователь Ранг: 21 |
 01.07.2008 // 21:36:47
Как приятно встретить товарищей по несчастью. Вступить в клуб жертв мы, конечно, согласны. Но хотелось бы еще получить какие-нибудь результаты. Мы сначала также проводили двухшаговую реакцию катехоламинов с бензиламином и дифенилэтилендиамином. После того, как реакция не пошла, провели дериватизацию серотонина, норадреналина, ГИУ и допамина только бензиламином - результат не отличался от предыдущего. Вроде делаем все, как описано в статье - и ничего не видим. А как у вас растворялась CAPS и дифенилэтилендиамин? Последний мы вообще не смогли растворить в 0,1 М HCl, как они предлагают. Детектор у нас - Shimadzu. RF-10Axl.
|
|||||
|
LVK Пользователь Ранг: 37 |
01.07.2008 // 22:59:06
Редактировано 1 раз(а) 5-гидроксииндолы + бензиламин: 2-фенил-4,5-пирролобензоксазолы (4 кольца - 2 от индола, одно от бензиламина и одно замкнувшееся из боковых заместителей ОН- и СH2NH2) сорри за терминологию, я не химик pdf могу выслать со схемой реакции, напишите e-mail |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
LVK Пользователь Ранг: 37 |
01.07.2008 // 23:31:05
Если брать такие концентрации стандартов, как у Youshitake, так и мы ничего не видим. Возьмите 10 мкМ серотонина и 100 нМ норадреналина или адреналина (рабочие растворы), далее по прописи 20 мкл раб. р-ра + 20 мкл реактива с бензиламином + 20 мкл реактива с DPE, 50 град С 20 минут в Гноме, 20 мкл смеси вколоть - всё прекрасно поделится, с высокими узкими пиками. Но у нас-то это порядка 100 пикомолей серотонина и 1 пикомоля NA или Адр на вкол, а у них по 50 фемтомолей этих же стандартов видны как на ладони. CAPS нормально растворяется, DPE в 0,1 N HCl лучше всего погонять через узкий наконечник против света (вортекс его почему-то не берет). А в чем же вы его тогда растворяете - в метаноле? |
|||||
|
Dezh Пользователь Ранг: 157 |
02.07.2008 // 9:10:58
Сбросьте dezh(c-а)analytech.ru |
|||||
|
Марианна Пользователь Ранг: 21 |
02.07.2008 // 14:01:52
Если брать такие концентрации стандартов, как у Youshitake, так и мы ничего не видим. Возьмите 10 мкМ серотонина и 100 нМ норадреналина или адреналина (рабочие растворы), далее по прописи 20 мкл раб. р-ра + 20 мкл реактива с бензиламином + 20 мкл реактива с DPE, 50 град С 20 минут в Гноме, 20 мкл смеси вколоть - всё прекрасно поделится, с высокими узкими пиками. Но у нас-то это порядка 100 пикомолей серотонина и 1 пикомоля NA или Адр на вкол, а у них по 50 фемтомолей этих же стандартов видны как на ладони. CAPS нормально растворяется, DPE в 0,1 N HCl лучше всего погонять через узкий наконечник против света (вортекс его почему-то не берет). А в чем же вы его тогда растворяете - в метаноле? После того, как у нас возникли проблемы с растворением DPE, мы пока дериватизируем только бензиламином. Но даже увеличив концентрацию рабочих растворов до указанных вами, не увидели на хроматограмме ничего, кроме двух эндогенных пиков. Внутренний диаметр колонки (в статье) 1,5 мм, а у нас 4,6 мм. Насколько это может влиять? Растворение CAPS в метаноле начинается только после подогрева и подщелачивания NaOH до pH 10,0. Поясните по поводу DPE - что значит "погонять против света". А, если не секрет, в чем вы определяете катехоламины? Мы пытаемся определить катехоламины в диализате мозга. |
|||||
|
LVK Пользователь Ранг: 37 |
02.07.2008 // 22:33:35
После того, как у нас возникли проблемы с растворением DPE, мы пока дериватизируем только бензиламином. Но даже увеличив концентрацию рабочих растворов до указанных вами, не увидели на хроматограмме ничего, кроме двух эндогенных пиков. Внутренний диаметр колонки (в статье) 1,5 мм, а у нас 4,6 мм. Насколько это может влиять? Растворение CAPS в метаноле начинается только после подогрева и подщелачивания NaOH до pH 10,0. Поясните по поводу DPE - что значит "погонять против света". А, если не секрет, в чем вы определяете катехоламины? Мы пытаемся определить катехоламины в диализате мозга. Не секрет, в плазме крови людей. В диализате мозга концентрации биогенных аминов, по-моему, еще ниже, чем в плазме. Но я пока говорю исключительно о стандартах - сколько видим мы и сколько Yoshitake. "Погонять против света" - это значит, что я даже в очках не вижу нерастворившихся кристалликов DPE, пока не помещу за эппендорфом яркую лампу. Может, другие и так увидели бы. Берете сэмплер на 200 мкл и тщательно пипетируете, пока не перестанут взлетать мелкие кристаллики, они почти прозрачные. Эппендорфы у нас тонкие, видно почти как через стекло. С CAPS вообще не пойму, какая у вас проблема. CAPS buffer pH 10,0 - это и означает, что нужно смешать CAPS с NaOH в таком соотношении, чтобы рН был 10,0. Потом уже добавляется всё остальное - бензиламин, феррицианид и метанол. Я не грею, всё и так растворяется. Колонка у нас сейчас 2 мм, раньше была 4,5 (тоже всё видели). |
|||||
|
Dezh Пользователь Ранг: 157 |
03.07.2008 // 9:39:51
Посмотрел статью. Представляется, что механизм данного процесса связан с окислением органики гексацианоферратом и образованием промежуточных активных форм как субстрата (окси-индольного фрагмента), так, в принципе и аминов (ВА и DPE). Гексацианоферрат является довольно сильным окислителем, особенно при высоких рН и темп-ре. Таким образом, можно, на мой взгляд, проверить одну вещь. В дериватизирующий раствор добавлять окислитель непосредственно перед дериватизацией. Также убедится, что гексацианоферрат у вас свежий. Чувствительность всегда можно поднять за счет пробоподготовки (типа ТФЭ). Если не поможет - вообще можно попробовать по аминогруппе замещать флуоресцеином и смотреть такие производные. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 21
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
