Форумы ANCHEM.RU: проблемы с дериватизацией катехоламинов

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

проблемы с дериватизацией катехоламинов >>>

  Ответов в этой теме: 21
  Страница: 1 2 3
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

LVK
Пользователь
Ранг: 37

03.07.2008 // 13:06:09

Dezh пишет:
Посмотрел статью. Представляется, что механизм данного процесса связан с окислением органики гексацианоферратом и образованием промежуточных активных форм как субстрата (окси-индольного фрагмента), так, в принципе и аминов (ВА и DPE). Гексацианоферрат является довольно сильным окислителем, особенно при высоких рН и темп-ре.
Таким образом, можно, на мой взгляд, проверить одну вещь. В дериватизирующий раствор добавлять окислитель непосредственно перед дериватизацией. Также убедится, что гексацианоферрат у вас свежий.
Чувствительность всегда можно поднять за счет пробоподготовки (типа ТФЭ).
Если не поможет - вообще можно попробовать по аминогруппе замещать флуоресцеином и смотреть такие производные.

Мы по-всякому пробовали, и свежеприготовленную дерив. смесь тоже; некоторая разница есть, но не 2 порядка. Меняли также концентрации реагентов, температуру и время дерииватизации, рН ацет буфера, колонки и проч. У нас, по-видимому, лампа детектора слабовата + щели увеличить нельзя. Ну, и колонки у японцев специфические, местного производства - может, чудодейственные

.

Над ТФЭ работаем. Но обидно смотреть на их хроматограммы, хочу еще попробовать заказать колонку из Tosohu точно такую же, как в одной из их предыдущих статей.

А Марианна, наверное, дважды метанол добавляет, в статье в этом месте действительно малопонятно написано.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Dezh
Пользователь
Ранг: 157

03.07.2008 // 13:15:25

LVK пишет:
У нас, по-видимому, лампа детектора слабовата + щели увеличить нельзя.

Да, лампу желательно проверить в таком случае и кювету промыть не помешает. А хроматограф какой? Срок службы?

Dezh
Пользователь
Ранг: 157

03.07.2008 // 13:20:15

Еще дело может быть вот в чем. В статье не описывается работа с жидкостями биологического происхождения, а ведь в пробе могут быть какие-то восстановители, способные быстро вывести окислитель. Нужно иметь ввиду.

LVK
Пользователь
Ранг: 37

03.07.2008 // 14:10:18

Хроматограф Agilent 1100, почти новый (активно используется года 2), флуор детектор G1321A.

Я имела в виду не загрязнение кюветы, за этим мы следим, а мощность лампы как таковой. Это ведь не оптич. плотность, а флуоресценция - чем выше мощность источника возбужд. света, тем выше интенсивность эмиссии (для одного и того же раствора). Раскрыть выходную щель пошире мы тоже не можем - щели постоянные 20 нм.

Что касается биол. образцов, нам их волей-неволей придется подчищать - хотя бы для того, чтобы сконцентрировать. А японцы просто депротеинизируют образцы (мочу еще и разводят в 10 раз).

Dezh
Пользователь
Ранг: 157

03.07.2008 // 14:19:36

LVK пишет:
Хроматограф Agilent 1100, почти новый (активно используется года 2), флуор детектор G1321A.

Я имела в виду не загрязнение кюветы, за этим мы следим, а мощность лампы как таковой. Это ведь не оптич. плотность, а флуоресценция - чем выше мощность источника возбужд. света, тем выше интенсивность эмиссии (для одного и того же раствора). Раскрыть выходную щель пошире мы тоже не можем - щели постоянные 20 нм.

Я так и понял. Я к тому, что мощность лампы снижается со временем, про это нельзя забывать.

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Ротационый испаритель UL-2000
Предназначены для проведения процессов, сопряженных с быстрым удалением растворителей из растворов или суспензий органических и неорганических соединений путем испарения при нормальном и пониженном давлении и контролируемой температуре. Объем испарительных колб от 25 мл до 2 л. Скорость вращения: 20-200 об/мин. Высота подъемника: 0-150 мм.

[ Информация из каталога оборудования ANCHEM.RU ]

Марианна
Пользователь
Ранг: 21

04.07.2008 // 14:20:36

LVK пишет:
Мы по-всякому пробовали, и свежеприготовленную дерив. смесь тоже; некоторая разница есть, но не 2 порядка. Меняли также концентрации реагентов, температуру и время дерииватизации, рН ацет буфера, колонки и проч. У нас, по-видимому, лампа детектора слабовата + щели увеличить нельзя. Ну, и колонки у японцев специфические, местного производства - может, чудодейственные .

Над ТФЭ работаем. Но обидно смотреть на их хроматограммы, хочу еще попробовать заказать колонку из Tosohu точно такую же, как в одной из их предыдущих статей.

А Марианна, наверное, дважды метанол добавляет, в статье в этом месте действительно малопонятно написано.

Здравствуйте. Спасибо за совет по CAPS (в статье-то указано - растворять в метаноле).
Растворы мы готовим так: Бензиламина гидрохлорид (0,3 М) - в 90% метаноле, CAPS (0,3М) - в 0,1М NAOH, получаем pH 10, гексацианоферрат (20 мМ)- в 50% метаноле; DPE (0.1 М) - в 0,1 М HCl, глицин (0,3 М) - в воде.
Реакционная смесь 1: бензиламин-CAPS-гексацианоферрат калия-метанол 2:6:3:24 (по статье).
Реакционная смесь 2 : глицин- DPE 1:2.
В каком месте не надо дважды добавлять метанол?
Первую реакцию м ы проводим при комнатной температуре 5 мин, вторую - при 50 градусах 20 минут.
Несмотря на увеличение концентраций стандартов мы по-прежнему не видим ничего, кроме двух эндогенных пиков. Т.е. у нас проблемы не с чувствительностью, а по-видимому, с реакцией.

LVK
Пользователь
Ранг: 37

04.07.2008 // 15:08:39

Редактировано 1 раз(а)

Марианна пишет:

Здравствуйте. Спасибо за совет по CAPS (в статье-то указано - растворять в метаноле).
Растворы мы готовим так: Бензиламина гидрохлорид (0,3 М) - в 90% метаноле, CAPS (0,3М) - в 0,1М NAOH, получаем pH 10, гексацианоферрат (20 мМ)- в 50% метаноле; DPE (0.1 М) - в 0,1 М HCl, глицин (0,3 М) - в воде.
Реакционная смесь 1: бензиламин-CAPS-гексацианоферрат калия-метанол 2:6:3:24 (по статье).
Реакционная смесь 2 : глицин- DPE 1:2.
В каком месте не надо дважды добавлять метанол?
Первую реакцию м ы проводим при комнатной температуре 5 мин, вторую - при 50 градусах 20 минут.
Несмотря на увеличение концентраций стандартов мы по-прежнему не видим ничего, кроме двух эндогенных пиков. Т.е. у нас проблемы не с чувствительностью, а по-видимому, с реакцией.

бензиламин и гексацианоферрат в воде, CAPS в воде (+ NaoH до рН 10 на рН-метре) и потом уже 2:6:3:24. У них там напутано, вы 2 раза метанол добавляете.
Остальное одинаково.

LVK
Пользователь
Ранг: 37

04.07.2008 // 15:13:24

Dezh пишет:

Я так и понял. Я к тому, что мощность лампы снижается со временем, про это нельзя забывать.

Там превентивная автокалибровка, поэтому с севшей в 100 раз (или даже в 10) лампой мы бы не смогли запустить софт. Я где-то слышала, что у аджилентовского флуор. детектора исходно слабоватая лампа. Хотя, возможно, мы где-то делаем ляп, подобный марианиному - делаем и не видим.

Dezh
Пользователь
Ранг: 157

04.07.2008 // 15:25:15

LVK пишет:
[Там превентивная автокалибровка, поэтому с севшей в 100 раз (или даже в 10) лампой мы бы не смогли запустить софт. Я где-то слышала, что у аджилентовского флуор. детектора исходно слабоватая лампа. Хотя, возможно, мы где-то делаем ляп, подобный марианиному - делаем и не видим.

Всё может быть, но севшую "в 10 раз" лампу можно считать недееспособной. Нормально когда выше 60% интенсивности от начальной мощности.

Dezh
Пользователь
Ранг: 157

04.07.2008 // 15:29:17

Кстати, яб на вашем месте посмотрел таки стабильность гексацианоферрата в условиях отсутствия аминов с вашими пробами.


Ответов в этой теме: 21 Страница: 1 2 3 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты