4.3. Неподвижные фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ

Методы жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции » ...

4.3. Неподвижные фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ

Большая часть современных аналитических приложений выполнена на обращенных фазах различного типа. Разработка обращенных фаз идет по пути решения сразу нескольких задач, среди которых можно выделить следующие:

Повышение гидролитической стабильности обращенных фаз на основе силикагеля. Фазы с улучшенной гидролитической стабильностью имеют более долгий срок службы, они более терпимы к агрессивным условиям (высокие концентрации неорганических солей, высокие рН), чем «обычные».
Повышение эффективности разделения основных (азотсодержащих) адсорбатов, улучшение формы их пиков. На специальных фазах можно проводить разделения основных фармацевтиков и алкалоидов на простых водноорганических элюентах без динамического модификатора (например, триэтиламина).
Синтез обращенных фаз, проявляющих улучшенную селективность разделения соединений определенной группы (определенной природы). Удерживание на таких фазах обусловлено, как правило, несколькими типами, среди которых обращенно-фазовый тип является доминирующим.
Синтез фаз, совместимых с водой и водно-солевыми буферами. При работе на таких неподвижных фазах с применением элюентов без добавки органического модификатора не присходит фазового коллапса – резкого уменьшения удерживания адсорбатов и эффективности их разделения вследствие несмачиваемости адсорбционного материала.
Синтез фаз для разделения соединений высокой гидрофобности (С30 привитые силикагели).

    Для синтеза обращенных фаз на основе силикагеля с повышенной гидролитической стабильностью существует два основных подхода.
    Первый подход состоит в применении в качестве основы для синтеза гидролитически устойчивого силикагеля нового типа (соль-геля, sol-gel), на который прививаются неполярные лиганды. Прививка ведется таким способом, чтобы как можно в большей мере блокировать силикагельную матрицу.
    Среди таких способов можно отметить:

Организацию на поверхности силикагеля полимерного слоя, предотвращающего контакт подвижной фазы с адсорбентом. С18 фазами с полимерным силиконовым покрытием являются Wakosil II C18AR (SGE), Capcell Pak C18 (Phenomenex).
Прививку лигандов Cl-Si(R₂)C₁₈H₃₇ с объемными «боковыми» заместителями R, бидентантных лигандов с общей формулой Cl-Si(CH₃)₂-R-(CH₃)₂Si-Cl. К последнему типу относится фаза Zorbax Extend C18 (Agilent Technologies).
Проведение интенсивного двойного эндкеппинга триметилхлорсиланом и/или диметилдихлорсиланом. К таким фазам относятся Wakosil II C18RS (SGE), Zorbax Eclipse XDB-C18 (Agilent Technologies), Hypersil BDS C18 (Thermo Hypersil - Keystone).

    Другой подход состоит в получении гидролитически стабильной обращенной фазы в один шаг, путем полимеризации триэтоксисиланов типа CH₃Si(OR)₃, RSi(OR)₃ и (RO)₃SiCH₂CH₂Si(OR)₃, где R – углеводородный радикал. Такой подход реализован фирмой Waters при синтезе адсорбентов серии XTerra. Иногда такие материалы называют гибридными, органически-неорганическими.
    Фазы приведенных типов могут эффективно применяться и для разделения основных соединений. Однако, для разделения основных соединений существуют также фазы, сконструированные по другому принципу. Он состоит в прививке к силикагелю в целом неполярных лигандов, однако содержащих в своей структуре полярную группу (polar-embedded group): карбаматную, простую эфирную или амидную – которая находится рядом с реакционным центром. Прививка в этом случае осуществляется таким способом, что полярная группа оказывается рядом с поверхностью силикагельной матрицы. При этом «силанольная активность», которая считается основной причиной уширения пиков основных соединений, подавляется за счет взаимодействия остаточных силанольных групп с полярной группой привитого соединения. Примером карбаматной фазы является SymmetryShield RP C18 (Waters), эфирной фазы – Polaris C18 Ether (Varian), амидных фаз – Discovery RP-AmideC16 (Supelco), Polaris Amide C18 (Varian). Любопытно, что фазы подобного типа, изначально сконструированные для разделения основных соединений, впоследствии стали позиционироваться как фазы с необычной селективностью и совместимостью с 100% водными подвижными фазами.
    Для синтеза фаз с хорошей совместимостью с водой и водными буферами наиболее часто применяется подход, состоящий в эндкеппинге остаточных силанольных групп полярными реагентами – «полярный эндкеппинг». Среди фаз, сконструированных по такому принципу, можно отметить Synergi Hydro-RP и Synergi Polar-RP (Phenomenex) (химия полярного эндкеппинга производителем не раскрывается).
    Наряду с хорошей совместимостью со 100% водными подвижными фазами, адсорбенты этого типа обладают и недостатками, прежде всего, достаточно низкой гидрофобностью, что выражается в слабом удерживании гидрофильных адсорбатов, а также невысокой метиленовой селективностью. Для более эффективного разделения гидрофильных соединений в 100% водных средах были разработаны специальные неподвижные фазы, не имеющие приведенных недостатков. К таким фазам относятся Atlantis dC18 (Waters) и Develosil RP-Aqueous (Nomura Chemical). Такие фазы эффективно применяются для обращенно-фазового разделения многих гидрофильных соединений, прежде всего, органических кислот и нуклеотидов.
    Для разделения липидов методом обращенно-фазовой хроматографии часто применяют безводные подвижные фазы, нередко содержащие липофильные модификаторы: ТГФ, ацетон, хлороформ. С18 привитые силикагели в подобных средах достаточно резко теряют эффективность разделения, по-видимости, из-за «разжижения», нарушения привитого слоя. Для эффективной работы в неполярных подвижных фазах на основе силикагеля сконструированы адсорбенты с привитыми С₃₀Н₆₂ лигандами – С30 фазы. Так, ProntoSIL 200-5-C30 (Bischoff) и Develosil Combi-RP (Nomura Chemical), новые фазы такого типа, могут применяться для разделения триглицеридов, жирорастворимых витаминов, изомеров каротиноидов.
    Многие обращенные фазы характеризуются необычными селективностями, которые обусловлены вкладами одного или нескольких типов удерживания в дополнение к основному обращенно-фазовому. Вклад нормально-фазового типа наиболее ярко проявляется на карбаматных и амидных обращенных фазах, а также на фазах с полярным эндкеппингом. Так, карбаматные фазы проявляют отличную от обычных С18 фаз селективность по отношению к катехинам, флавонолам. На фазах с полярным эндкеппингом в «нестандартной» последовательности элюируются водорастворимые витамины, причем, как было замечено, этот порядок весьма сильно зависит и от типа применяемого буфера.
    Вклад квази-нормально-фазового типа проявляется при хроматографировании ароматических соединений в обращенно-фазовых условиях на фазах, содержащих ароматические π-донорные/акцепторные фрагменты. Среди таких «обращенных» фаз на основе силикагеля можно выделить пентафторфенильные фазы: Discovery F5 HS (Supelco), FluoroSep-RP Phenyl HS (ES Industries). Полистирольные фазы PRP-1 (Hamilton), PLRP-S (Polymer Labs), PolymerX RP-1 (Phenomenex) также считаются обращенными, хотя проявляемая ими селективность указывает на значительный вклад квази-нормально-фазового типа удерживания. Наибольший вклад квази-нормально-фазового типа наблюдается для пористой графитированной сажи Hypercarb (Thermo Hypersil - Keystone) и сверхсшитого полистирола Chromalite 5HGN (Purolite).