| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Спектрофотометрическое определение аденозинтрифосфорной кислоты >>>
|
 |
| Автор | Тема: Спектрофотометрическое определение аденозинтрифосфорной кислоты | |||||
|
leonid Пользователь Ранг: 3 |
 11.02.2013 // 15:58:59
Всем привет! Буду очень признателен за помощь!!! Передо мной стоит задача - количественное измерение АТФ ( источник его мясной сок) с помощью спектрофотометра. Аппарат spekol 1500, вроде рабочий, проверяли корреляцию между оптической плотностью и концентрацией на стандартных растворах. Есть множество методик измерения ДНК и РНК, а по АТФ не могу ничего найти. Есть ли у кого мысли, начиная от "как выделить АТФ из раствора мясного сока", заканчивая как измерить его концентрацию на спектрофотометре, сам пытался определить максимум поглощения АТФ на растворе для инъекций из аптеки, но аппарат показал пик в зоне выше разрешения самого графика, в итоге разбавлял пока не определил - максимумов оказалось 2 ( ПЕРВЫЙ В ПРИ 217 И ВТОРОЙ ПРИ 263НМ), а в литературе пишут один при 260. Ну а основных вопросов получается 2 - как АТФ выделить из раствора и как померить концентрацию АТФ на спектрофотометре. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Rudy Пользователь Ранг: 385 |
11.02.2013 // 18:43:39
Для начала промеряйте спектр поглощения расворителя относительно "воздуха" (пустого кюветного отсека). С длины волны, где оптическая плотность расворителя превышает 0,3 и короче, где оптическая плотность начнёт резко возрастать результаты определения максимума можете не рассматривать вовсе. Проблема в том, что закон Бугера работает для данной длины волны, а в реальном приборе измерение идёт по сумме отношения интенсивности света на данной длине волны + рассеянный свет и люминесценция (РСЛ) (обычно более длинноволновые и не поглощающиеся). В коротковолновой области, где растворитель погдощает практически весь свет данной длины волны остаётся только РСЛ и отношение РСЛ до и после кюветы одинаковое, стало быть 1 и логарифм от этой величины, то есть оптическая плотность, равно нулю (так показывает прибор). На практике это приводит к появлению ложного максимума в промежуточной спектральной области (между оптич. плотн 0,3 и более), поскольку доля РСЛ нарастает по мере уменьшения длины волны. Картинка характеризуется резким спадом в сторону коротких длин волн (поскольку резкий подъём оптической плотности) и упирается в "0". На приборах с ФЭУ обычно имеется автоматическая регулировка усиления (АРУ), которая осуществляется увеличением напряжения на ФЭУ и дополнительный критерий - резкое увеличение шумов. Резюме: измеряйте свет там, где он есть и не измеряйте там, где его нет. |
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
11.02.2013 // 19:23:02
Мясной сок содержит массу веществ не относящихся к АТФ. Это раз. Во-вторых АТФ - очень "хлипкое" соединение очень быстро дающее три продукта деградации :АДФ,АМФ и аденозин. Определить содержание АТФ одной спектрофотометрией получится врядли. Обычно для этих целей используют ОФ ВЭЖХ хроматографию с УФ детектированием при 260 нм. Если стоит задача ОПРЕДЕЛИТЬ, то надо поднять старенькую ВФС,, где АТФ выделяют на коротких колоночках с ионообменным сорбентом. |
|||||
|
leonid Пользователь Ранг: 3 |
11.02.2013 // 20:29:33
Garry, очень ждал, что Вы напишите, читал ваши ответы за 2006 год про спектроскопию ДНК и РНК. и практикум МГУшный скачал- ознакомился. Да действительно, АТФ в мясном сырье распадется чуть ли не за 2 часа, с этим мы вопрос почти решили, задача стоит в количественном определении АТФ мясном соке, может у вас все таки есть мысли или наработки, как за не очень долгую пробподготовку, можно прийти к непосредственному ее измерению на спектрофотометре, сама в этом не очень силен, но мне кажется можно либо на прямую либо косвенно определить количество АТФ, просто никак не соображу, что можно осадить и по остаткам чего можно косвенно определить его содержание. |
|||||
|
leonid Пользователь Ранг: 3 |
11.02.2013 // 20:33:04
Или,например, может сам сок сделать фоном, а потом в этом же соке как-то АТФ нейтрализовать и соответственно через сравнение придти к его количеству? Такое возможно, или это глупость? |
|||||
|
metrim Пользователь Ранг: 646 |
12.02.2013 // 22:06:41
Можете попробовать кит с люциферазой |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
Garry VIP Member Ранг: 1076 |
13.02.2013 // 10:49:52
Ну, чисто АТФ определить спектрофотометрией будет задачей нелегкой, поскольку отделить ее от связки АДФ+АМФ без хроматографии практически невозможно. Разве что на каких-нибудь афинных колонках. Поэтому под АТФ будем подразумевать смесь АТФ+АДФ+АМФ (пропорции не знаю, поскольку это задача с многими неизвестными...). На этапе становления производства ампулированной АТФ у нас на фарм.заводе, первоначально сырье было как раз получено из мышц молодых телят. Нам уже поставляли готовую субстанцию, которая этот комплекс и содержала с соотношением примерно АТФ(60-65 %), АДФ (25-30%), остальное АМФ и аденозин. А уж потом сырьем служила субстанция микробиологического происхождения, где АТФ - практически 95 %. Значит, как я предполагаю решение Вашей проблемы. Варианта два, и оба из разряда твердофазной экстракции. 1- обыкновенные С18 картриджи от БиоХимМака или их полистирольные патроны. К 3-5 мл (депротеинизированного 10 % ТХУ) мясного сока добавляют какой-нибудь ион-парный реагент из разряда четвертичных аммониевых соединений (тетрабутиламмония сульфат, ундецилтриметиламмония сульфат или цетримид) до концентрации 0,02 М (нужно будет посчитать сколько добавлять более концентрированного раствора). Смесь мясного сока и раствора ион-парного реагента перемешать и пропустить через кондиционированный патрон. Ну а далее как в классике жанра, промыть водой и смыть все что осталось (преимущественно АТФ и иже с нею) ацетонитрилом или метанолом, довести раствор до 10 мл и определить количество АТФ комплекса по сравнению с эталонным раствором, приготовленным аналогично из чистой субстанции АТФ. Второй вариант предполагает использование ионообменных картриджей типа Oazis AX (могу ошибиться с аабревиатурой , короче с анионообменными свойствами). Ну а схема извлечения должны быть взята из инструкций фирмы для этих патронов. При этом, конечно исключается необходимость в ион-парном реагенте. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 6 |
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
