Российский химико-аналитический портал  химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов  
карта портала ::: расширенный поиск              
 


ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...
  1. Аналитический форум | Список форумов | Войти в систему | Регистрация | Помощь | Последние темы | Поиск

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Определение жирных кислот в биоматериале >>>

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]


Автор Тема: Определение жирных кислот в биоматериале
OYura
Пользователь
Ранг: 45

14.01.2011 // 14:25:22     
Работаю на ГХ Кристалл 2000М, капиллярная колонка НР 52 м. Определяю жирные кислоты в маслах.
Необходимо провести анализ ЖК в мембранах клеток. Такого никогда не делал .
Как правильно провести экстракцию? Может у кого есть методики по этому поводу. Помогите пожалуйста.
ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
virtu
VIP Member
Ранг: 2133


14.01.2011 // 14:47:00     
Смотрите в журналах биохимической направленности, типа Analytical Biochemistry и т.д. Вам нужно подходящий протокол "выделения" плазматических липидов найти, а дальше, как "обычно".

Посмотрите еще здесь:

lipidlibrary.aocs.org/lipids/whatdo/index.htm

Еще на molbiol.ru загляните.
OYura
Пользователь
Ранг: 45


15.01.2011 // 18:10:24     
Гексан:метанол 2:1 подойдет для экстракции липидной фракции?
LVD
Пользователь
Ранг: 219


17.01.2011 // 9:34:47     
Да. Можно смесь хлороформ-метанол-вода в соотношении (2:1:0.8 v/v/v) ну и антиоксидант (напр. ионол) не помешает.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302


17.01.2011 // 21:20:49     
Редактировано 3 раз(а)

Если вы намереваетесь исследовать липиды мембран, а именно входящие в их состав жирные кислоты, то необходимо провести количественную двухстадийную экстракцию в токе аргона смесями хлороформ:метанол:вода и хролоформ:метанол:соляная кислота с 0,001% ионола в т.н. "аппарате Жукова" - даже для стеклодува средней руки его конструкция не составит особого труда [1]. Данный метод, при всей его трудоёмкости - экстракция занимает несколько часов - обеспечивает количественный выход липидов на уровне 99,73% (мой личный "рекорд") (экстрагируемость оценивали путём прямого омыления неэкстрагируемого остатка растительной ткани в экстракторе в присутствии маргариновой кислоты в качестве IS).
Так как нам неизвестен ваш объект, то рекомендую полученный экстракт дополнительно "почистить" от триацилглицеринов и прочих неполярных липидных фракций с помощью ТСХ или на колонке на окиси алюминия - вы получите фракцию "полярных" липидов (стеринов, фосфоглицеринов и т.д.) [2] вот ее-то и подвергайте омылению с последующим метилированием свободных жирных кислот и ГЖХ, ГХ-МС анализам [3,4, 5] )
Так это выглядит в общих чертах,
нужны подробности - с удовольствием поделюсь )

PS
1. Zhukov A.V., Vereshchagin A.G. Quantitative content of total polar lipids in soybean seeds // J. Amer, Oil Schem Soc. 1976. Vol. 53, p 1-7
2. Zhukov A.V., Vereshchagin A.G Current techniques of extraction, purification and preliminary fractionation of polar lipids of natural origin // Adv Lipid Res. 1981. Vol. 18. P. 247-282
3. Бережная, Г.А. Определение жирнокислотного состава и количественного содержания липидов в плодах облепихи / Г.А. Бережная, И.П. Елисеев, В.Д. Цыдендамбаев, А.Г. Верещагин // Прикл. биохимия и микробиология. – 1988. –Т. 24. – С. 568–573.
4. Пчелкин, В.П. Определение позиционно-видового состава запасных триацилглицеринов растений методом неполного химического деацилирования / В.П. Пчелкин, Э.И. Кузнецова, В.Д. Цыдендамбаев, А.Г. Верещагин // Физиология растений. – 2001. – Т. 48. – C. 809-816.
5. Tsydendambaev V.D., Christie W.W., Brechany E.Y., Vereshchagin A.G. Identification of Unusual Fatty Acids of Four Alpine Plant Species from the Pamirs //Phytochemistry. 2004. V.65, p. 2695-2703

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777


18.01.2011 // 1:50:13     
Редактировано 1 раз(а)


OYura пишет:
Работаю на ГХ Кристалл 2000М, капиллярная колонка НР 52 м. Определяю жирные кислоты в маслах.
Необходимо провести анализ ЖК в мембранах клеток. Такого никогда не делал .
Как правильно провести экстракцию? Может у кого есть методики по этому поводу. Помогите пожалуйста.


Вы хотите ЖК в мембранных липидах, или свободные ЖК в мембранах, если таковые найдутся?

Если экстрагировать липиды, то классика:

Bligh EG, Dyer WJ: A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 1959, 37:911-917.

Folch JM, Lees, M., Sloane-Stanley, G. H.: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J Biol Chem 1957, 226:497-509.

Эти две статьи типа "golden standard", но в наших руках Folch работает лучше.

Довольно удачный "упрощенный" метод с MTBE:

Matyash V, Liebisch G, Kurzchalia TV, Shevchenko A, Schwudke D: Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res 2008, 49:1137-1146.

В принципе, экстрагируется все кроме гликолипидов, но эти надо делать в зависимости от того что а клетки. Ну и конечно PIP / PIP2 / PIP3 вообще делаются по другому, это вообще другой мир.
Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246
БИОМЕР, НПП БИОМЕР, НПП
Разработка, производство и продажа анализаторов для пищевой промышленности. Ультразвуковые анализаторы для анализа молока, пива, вина, ликероводочных изделий. Оборудование для потенциометрии – модельный ряд рН-метров и иономеров. Комплексное оснащение лабораторий. На базе выпускаемого оборудования разработка методик выполнения измерений для конкретных прикладных задач.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302


18.01.2011 // 1:56:46     

Spectrometrist пишет:

OYura пишет:
Работаю на ГХ Кристалл 2000М, капиллярная колонка НР 52 м. Определяю жирные кислоты в маслах.
Необходимо провести анализ ЖК в мембранах клеток. Такого никогда не делал .
Как правильно провести экстракцию? Может у кого есть методики по этому поводу. Помогите пожалуйста.

Вы хотите ЖК в мембранных липидах, или свободные ЖК в мембранах, если таковые найдутся?

Если экстрагировать липиды, то классика:

Bligh EG, Dyer WJ: A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 1959, 37:911-917.

Folch JM, Lees, M., Sloane-Stanley, G. H.: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J Biol Chem 1957, 226:497-509.

Эти две статьи типа "golden standard", но в наших руках Folch работает лучше.

Довольно удачный "упрощенный" метод с MTBE:

Matyash V, Liebisch G, Kurzchalia TV, Shevchenko A, Schwudke D: Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res 2008, 49:1137-1146.

В принципе, экстрагируется все кроме гликолипидов, но эти надо делать в зависимости от того что а клетки. Ну и конечно PIP / PIP2 / PIP3 вообще делаются по другому, это вообще другой мир.


СЖК в мембранах - ошибка исследователя, но не природы ) не может их там быть... СЖК в растительной клетке вообще ОЧЕНЬ большая редкость.. чаще артефакт..
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302


18.01.2011 // 2:13:03     
А, вот еще вспомнил, для ГЖХ анализа MEFA неплохо бы провести калибровку хроматографа с помощью готовых стандартов - смеси метиловых эфиров главных кислот с заведомо известной концентрацией и сравнить полученные данные с помощью ГЖХ путем интеграции пиков - так вы сможете вывести поправочные коэффициенты...
Подробнее можно почитать у Cristie или у Пчелкина В.П. в работе "Распределение необычных жирных кислот в триацилглицеринах масла околоплодника облепихи" (Физиология растений, 2006, том. 53 №3)
LVD
Пользователь
Ранг: 219


18.01.2011 // 8:40:23     
to Chamomillablue
По-видимому, Вы один из соавторов вышеуказанного ( с аппаратом Жукова) метода?
Я думаю, что это один из возможных методов. И Кристи и блай и Дайер и современные группы исследователей в США, в Великобритании, наши во Владивостоке, обходятся без 2стадийной экстракции и выход липидов (у Владивостокцев, по крайней мере, то что я знаю) высокий 97-98%.
Что касается свободных жирных кислот в растительной клетке, то они там появляются как в результате работы фосфолипазы А, активируемой кальцием, так и в результате ПОЛ.
OYura
Пользователь
Ранг: 45


18.01.2011 // 13:10:29     
Большое спасибо.
Хроматограф откалиброван стандартной смесью метиловых эфиров. Калибровка, да и вся работа (с маслами) проводилась в растворах гексана (он первый вылетает с колонки и его пик не накладывается на пики метиловых эфиров). Пробоподготовка несложная: капля масла в 2 мл гексана, плюс 0,2 мл метилата натрия, на фильтр и готово. Анализ проводится методом внутренней нормализации: все пики 100% и соответственно по компонентах.
Необходимо провести анализ жирнокислотного состава мембран эритроцитов (они уже выделены и заморожены). Еще предстоит пересылка (4 часа).
Может пусть их сразу на месте проэкстрагируют смесью хлороформ: метанол:вода (какое соотношение?)?
Дальше метелирование просто в этой системе и на хроматограф?
Ионола у них нет пока, может какой-нибудь другой антиоксидант можно применить?
Для начала хотелось бы попроще.
Подробности очень интересуют и фракционирование хотелось бы поставить в ближайшем будущем.
Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302


18.01.2011 // 18:09:55     
Редактировано 2 раз(а)


LVD пишет:
to Chamomillablue
По-видимому, Вы один из соавторов вышеуказанного ( с аппаратом Жукова) метода?
Я думаю, что это один из возможных методов. И Кристи и блай и Дайер и современные группы исследователей в США, в Великобритании, наши во Владивостоке, обходятся без 2стадийной экстракции и выход липидов (у Владивостокцев, по крайней мере, то что я знаю) высокий 97-98%.
Что касается свободных жирных кислот в растительной клетке, то они там появляются как в результате работы фосфолипазы А, активируемой кальцием, так и в результате ПОЛ.

Нет, я не являюсь соавтором. Просто на первых этапах работы пользовался этим методом и он оказался очень удобным для количественной экстракции, когда необходимо проанализировать все классы липидов, особенно полярных.
Сейчас мы от этого метода отказались, так как липиды мембран нас не интересуют и пользуемся сокращенной методикой экстракции абсолютным хлороформом в делительной воронке с водой. Водная фаза позволяет дополнительно отделить экстракт от углеводов и некоторых протеинов и прочих гидрофильных компонентов.
Одной из причин, по которой пришлось перейти на "безметанольную" экстракцию стало то, что в нашем объекте, видимо, существуют ферменты, сохраняющие активность после замораживания ткани и ее фиксации в кипящей воде. Эти ферменты этерифицировали ЖК с образованием комплекса МЕ-эфиров даже при комнатной температуре и пониженной, за счет тока аргона, испаряющего из экстрактора хлороформ, и всего за 2-3 часа. Признаюсь, такую ферментативную активность мы наблюдали впервые..

P.S. сколько на своей памяти не анализировал растительные экстракты, СЖК не встречал. Были один раз, но это оказалось ошибкой пробоподготовки и длительного хранения экстракта в изопропаноле, в результате чего разрушились триацилглицерины и дали эти СЖК.

  Ответов в этой теме: 13
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

Ответ на тему


ААС, ИСП-АЭС, ИСП-МС - прямые поставки в 2022 году

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU:      [ Все новости ]


ЖУРНАЛ ЛАБОРАТОРИИ ЛИТЕРАТУРА ОБОРУДОВАНИЕ РАБОТА КАЛЕНДАРЬ ФОРУМ

Copyright © 2002-2022
«Аналитика-Мир профессионалов»

Размещение рекламы / Контакты