Форумы ANCHEM.RU: Стерины. Выделение, очистка

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Стерины. Выделение, очистка >>>

  Ответов в этой теме: 40
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

28.02.2012 // 22:21:11

Редактировано 7 раз(а)

Дмитрий (anchem.ru) пишет:
Может кто делал лично через омыление водным КОН гексанового раствора масла с последующим уколом гексановой фракции? что там остается в гексане?

При просто омылении по ГОСТу метанольным 10% КОН на хроматограмме кроме метанольных эфиров видели и терпенов несколько (но меньше "штук", чем при анализе паровой фазы с концентрированием).

Я бы предложил начать с аналитической ТСХ, чтобы понять какие классы липидов и веществ помимо ТАГ в нём есть, а во-вторых решить что именно из этого вас интересует и как с этим работать.
По своему опыту могу сказать, что мне удавалось собирать достаточное для ГХ-МС количество неполярных фракций всего из 100 мг хлороформного экстракта с помощью препаративной ТСХ на силикагеле. Например, нативных эфиров ЖК с низшими одноатомными спиртами, которых не более 0,5% от массы экстракта:
Пластинку с силикагелем, предварительно пропитанную 0,001% метанольным или ацетоновым р-ром 2'7'-дихлорфлюоресцеина, нанести масло(экстракт) и в системе н-гексан:диэтиловый эфир 95:5 или 96:4 разогнать.
ТАГи и всё прочее "полярное" останется на уровне Rf 0.3, а вот выше ТАГ можно будет собрать эфиры каротиноидов, эфиры стеринов, углеводороды от кутикулярных восков и прочее "неполярное".
Если нужно выделить ТАГи и другие ацилглицерины, следует взять систему н-гексан:диэтиловый эфир 7:3..
В общем, не стоит забывать старый добрый тонкий слой — в подобных вопросах он как раз идеален

И прибор не засрёте

Старшие коллеги говорят, что работая с насыпным слоем, можно разово делить до 700 мг масла. Я подобным уже не пользовался, так как с началом работы на хромассе концентрация аналитов уменьшилась. Там, где раньше нужно было мг 50 - на набивной колонке, например, теперь можно обойтись 100 мкг

Поэтому для некоторых целей вполне хватает ТСХ-пластин ёмкостью до 25 мг.

***

Если же хочется непременно омылить и собрать неомыляемые компоненты, то в неомыляемых вероятнее всего окажутся пигменты, фенолы, свободные стерины, высшие жирные спирты, продукты деградации органических соединений и т.д. в зависимости от объекта и способа экстракции. Но я бы рекомендовал омылять не в водном растворе — выход маленький, а ТАГи так вообще можно часами кипятить без особого профита, и не в метанольном, а в 10% KOH в 90% водном этаноле или метаноле — что больше нравится. В метаноле выход выше. Если же взять чистый спирт, то непременно образуются эфиры. В водном этого не случается.
Однако, не стоит забывать, многое из вас интересующего не любит горячей щелочи — рискуете на ГХ-МС поймать только ножки, да рожки. Можно попробовать мягкое омыление с помощью гидроокиси тетраметиламмония или применить ферментный гидролиз - холестерол-эстеразами, например, но они аццки дорогие. Но оба последних метода требуют фракций, максимально свободных от эфиров глицерина с жирными кислотами.

***
Если какие-то методические подробности нужны по ТСХ растительных липидов, то спрашивайте — подскажу, дабы заново не изобретать велосипеда вам

P.S. Если минорных компоментов хочется получить "ведёрное" количество, то можно заморочиться, при условии, что не жалко а. времени, б. терпения, в. - растворителей, препаративной колоночной хроматографией на окиси алюминия. Но я бы начал с ТСХ, т.к., имхо, без неё в вашем случае не обойтись, даже если работать с "промывкой масла" спиртом, часть ТАГ все-равно в нем растворится, а колоть, скажем, углеводороды с ТАГами - кощунство для системы!

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

28.02.2012 // 22:40:13

Редактировано 1 раз(а)

kot пишет:
Попробовали.
1. При стоянии спиртовый экстракт мутнеет не более того.
2. ТСХ картинку прикладываю.
www.biomer.ru/index.php?part=library&article_id=138
Пластинка Мерковская, проявляли серной. Извиняюсь за качество картинки (артефакты, "кривые" зоны), это так сказать пробный вариант. НО! Лично мне не нравится "общий вид". Явно выраженных селективных зон (пусть например ХС и ситостерина) как-то не видно. Причем с реальными продуктами (мороженое, молоко итд) картинка еще хуже.
Буду благодарен за любые наставления на путь истинный
Можно прямо на сайте компании

Для стеринов хорошая ПФ - это н-гексан:диэтиловый эфир:ледяная уксусная 70:30:2. Какая была у вас? (Кстати, картинку так и не удаётся посмотреть)
Во-вторых, зачем вы мучаетесь с обугливанием серной кислотой, если есть универсальный проявитель: 4% р-р фосфорномолибденовой кислоты в 50% этаноле\метаноле\изопропаноле (на ваш вкус)? Достаточно после опрыскивания 5-8 минут выдержать пластинку в сушильном шкафу при +120 градусах.
В-третьих, для стеринов и их эфиров существует специфическая реакция — окрашивание по Либерману-Бурхарду: пластинку проявляют смесью концентрированной серной:ледяной уксусной 1:1. При выдерживании в сушильном шкафу появляются сиреневые и розовые пятна стеринов. Но для этой реакции лучше работать на стеклянных пластинах со спечённым слоем силикагеля или такие, где сорбент закреплён гипсом. Если возьмёте крахмальную, то всё осыпется и ничего не увидите.

P.S. А чем вас не устраивает препаративный тонкий слой для выделения стеринов? )

Дмитрий (anchem.ru)
Администратор
Модератор форума
Ранг: 4450

29.02.2012 // 0:52:26

Редактировано 3 раз(а)

к сожалению ТСХ задействовать нет возможности

просто вопрос - удается ли увидеть больше минорных компонентов через экстракцию метанолом или этанолом?

Как я и писал выше, мы не собираемся при этом колоть вместе с перешедшими ТАГами, все будет упарено и перерастворено в гексане, а дальше стандартная процедура с метанольным 10% КОН. Просто есть предположение что изменится отношение минорных компонентов по отношению к ТАГам (нам бы еще порядок

).

простой этерификацией (иправлено вместо неверного "омыления") и заколом - уже сделали, видим только три из 5 терпенов, обнаруженных анализом паровой фазы (через продувку и улавливание, затем термодесорбция). Ничего более из интересного увидеть не удалось - только метиловые эфиры. Снижать сплит не хочется, и так основной компонент с перегрузом на колонке... Полного фракционирования добиваться задача не стоит. Нужно просто зацепить максимум компонентов при минимальных трудозатратах для сравнения.

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

29.02.2012 // 0:57:31

Редактировано 1 раз(а)

Дмитрий (anchem.ru) пишет:
к сожалению ТСХ задействовать нет возможности

просто вопрос - удается ли увидеть больше минорных компонентов через экстракцию метанолом или этанолом?

простым омылением и заколом - уже сделали, видим только три из 5 терпенов, обнаруженных анализом паровой фазы (через продувку и улавливание, затем термодесорбция). Ничего более из значимого увидеть не удалось - только метиловые эфиры. Снижать сплит не хочется, и так основной компонент с перегрузом на колонке...

В спирт легко уйдут и стерины, и моноглицериды и куча прочей дряни, который в одном анализе разделить не получится и можно загадать прибор.
Если не хочется снижать сплит, можно попробовать в методе анализа прописать выключение детектора на период выхода основного пика javascript:smileyInsert(topicform.message, '

');
Плюс, терпены\изопреноиды могут блестяще разваливаться еще в испарителе. К ним лучше HPLC-DAD

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

29.02.2012 // 0:59:13

Редактировано 1 раз(а)

Пользователь удалил свое сообщение

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Хроматэк
ЗАО СКБ "Хроматэк" разрабатывает и производит газохроматографическое оборудование с 1991 года. Разработка и производство аналитического оборудования и программного обеспечения (ГХ, ГХ-МС, ВЭЖХ, ЯМР), комплексное внедрение и методическая поддержка, техническое обслуживание, разработка и освоение новых методов анализа, учебные курсы для пользователей и сервисных инженеров.

Дмитрий (anchem.ru)
Администратор
Модератор форума
Ранг: 4450

29.02.2012 // 1:00:06

Редактировано 1 раз(а)

Chamomillablue пишет:
В спирт легко уйдут и стерины, и моноглицериды и куча прочей дряни, который в одном анализе разделить не получится и можно загадать прибор.
Если не хочется снижать сплит, можно попробовать в методе анализа прописать выключение детектора на период выхода основного пика

глицериды не страшны - так как этерификация (иправлено вместо неверного "омыления").

а вот "выключение детектора", то есть видимо катода - это примерно как страусу голову в песок... не вижу - значит на колонку и в источник ничего не идет

Дмитрий (anchem.ru)
Администратор
Модератор форума
Ранг: 4450

29.02.2012 // 1:03:20

Chamomillablue пишет:
Плюс, терпены\изопреноиды могут блестяще разваливаться еще в испарителе. К ним лучше HPLC-DAD

Вот тут совсем не соглашусь

мыть просто инжектор надо

и дезактивировать, и снижать температуру. И что мне толку от HPLC, если нам идентификация нужна?

Chamomillablue
Пользователь
Ранг: 1302

29.02.2012 // 1:09:21

Редактировано 1 раз(а)

Дмитрий (anchem.ru) пишет:

Chamomillablue пишет:
Плюс, терпены\изопреноиды могут блестяще разваливаться еще в испарителе. К ним лучше HPLC-DAD
Вот тут совсем не соглашусь мыть просто инжектор надо и дезактивировать, и снижать температуру. И что мне толку от HPLC, если нам идентификация нужна?

Я не знаю что у вас за объект и как мы это масло получали. Поэтому по умолчанию рассматриваю полную схему "экстракта" в котором может быть все - от ТАГ, ДАГ, МАГ, МГДГ, СГДГ до свободного бета-каротина, лютеина etc. Омыление тотального экстракта даст вам столько артефактов, что замучаетесь нобели считать.
И... я пока не видел ни одной статьи по ГХ бета-каротина или фитоена - чем не изопреноиды, которые прекрасно разваливаются еще до входа в колонку?

А многое еще развалится при омылении

)

Witaliy
Пользователь
Ранг: 171

29.02.2012 // 1:10:05

Дмитрий, если нет возможности сделать ТСХ, то можно выполнить пробоподготовку и экстракцией (хотя это и похуже). В фармакопеях встречал примерно такой вариант: 20г масла+ 50 мл гексана, экстракция смесью 75:25 метанолом:вода. Метанольный экстракт упаривают под вакуумом, перерастворяют в хлоформе. Метод для антиоксидантов в маслах. Делал год назад на гх/мс, ничего не упаривал

Witaliy
Пользователь
Ранг: 171

29.02.2012 // 1:17:40

Да, вспомнил, перед отделением метанольного экстракта дополнительно охлаждал около двух часов (если есть центрифуга, можно метанольный охлажденный экстракт еще и "покрутить"). Триглицеридов практически не видел (работал на 15м колонке).


Ответов в этой теме: 40 Страница: 1 2 3 4 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты