| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
препаративная ВЭЖХ белков >>>
|
 |
| Автор | Тема: препаративная ВЭЖХ белков | ||
|
epanchintsev Пользователь Ранг: 14 |
 05.04.2013 // 9:01:25
Редактировано 1 раз(а) Уважаемые знатоки. Стоит задача препаративной очистки белка на RP-HPLC Колонка Vydac 218 TP Белок 20 кДа Буфер А 30% Ацетонитрил с ТФУ Буфер Б 80% Ацетонитрил с ТФУ перед проведением хроматографии белок находится в ацетатно-солевом буфере с концентрацией белка 2-4 мг на мл всего за один цикл планируется очищать 400 - 800 мг белка. Таким образом на препаративную колонну (наверное диаметр 2 см высота 25 см) предполагается наносить 200 мл водного раствора белка за 1 цикл, затем переводить колонну в буфер А и запускать градиент. вопрос как мне лучше нанести такой объем на колонну, если стандартные автосэмплеры и петли для образца на полупрепаративных системах (напр. Agilent) имеют объем порядка 10 - 20 мл. Какие сложности меня будут подстерегать если я стану наносить образец без петли и автосэмплера - прямо системным насосом - прямо на колонну. Ясно, что самым простым решением стало бы предварительное концентрирование белка в 10-20 раз, но по условиям задачи такой вариант не возможен (ввиду административных соображений). Спасибо |
||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|||
|
epanchintsev Пользователь Ранг: 14 |
05.04.2013 // 9:15:52
2. Достаточа ли колонка таких размеров (2 х 25 см ) для очистки белка в количестве 0,5 - 1,0 грамм, или лучше сразу ориентироваться на колоннки больших диаметров. 3. Можно ли расчитывать, что с колонках диаметром 2 - 5 см будет нормально работать на системе типа или это агилент слишком оптимистичен |
||
|
epanchintsev Пользователь Ранг: 14 |
05.04.2013 // 9:44:41
4. Не будет ли проблемой для этой колонки, если наносить на нее водный раствор белка (типа наступит "коллапс фазы") , или лучше будет бухнуть прямо в пробу ацетонитрила. Если да - то в каких количествах. Как себя при этом будут чуствовать белки в пробе и не начнет ли выпадать соль из буфера. "как страшно жить". |
||
|
Alex_K Пользователь Ранг: 77 |
05.04.2013 // 15:12:33
По-моему Вам лучше подумать о гель-фильтрационной хроматографии |
||
|
Волгин VIP Member Ранг: 1327 |
05.04.2013 // 16:15:36
1. Особых проблем с нанесением насосом у Вас возникнуть не должно. Можно "бухнуть прямо в пробу ацетонитрила" процентов до 10 и проблема с "коллапсом", вернее, со смачиванием сорбента элюентом отпадет. Но конечно проверить, не выпадет ли белок в осадок на небольшом колочестве стоит. Значительно важнее другая проблема - перезарядка компонентов пробы из первоначального буфера в элюент (неграмотно выразился, но, надеюсь, Вы меня понимаете: из ацетатной формы в трифторацетатную, изменение рН тоже чревато последствиями для белка) Поэтому стоит сначала минут 5-10 покачать 10%ACN с TFA, а уже потом начинать градиент. Здесь тоже не помешает предварительный эксперимент в аналитическом масштабе. Последнее относится и к последующему пункту. 2. Нагрузка. Все зависит от характера примесей.Иногда граммовые колисества целевого компонента можно выделять и на аналитической колонке 4.6х250мм. Но это очень специальные случаи и техники. Если же есть очень близкие примеси, то и 50х250 может не помочь. 3. > "...колонках диаметром 2 - 5 см..." Я бы не рекомендрвал гонять насос на максимальной скорости - 100 мл/мин, но на 70 - 80 вполне можно работать на колонках внутренним диаметром 50 мм. Мы работаем на таких системах с 20 - 30 мм колонками при объемной подаче (ГОСТовский термин) 50мл/мин. Кроме того, белки и пептиды обычно лучше делятся при несколько меньших скоростях, чем низкомолекулярные соединения. 4. Жизнь прекрасна и удивительна! Весна-с!!!  |
||
|
epanchintsev Пользователь Ранг: 14 |
05.04.2013 // 17:16:58
спасибо ОГРОМНОЕ занимаюсь, в основном, FPLC c ВЭЖХ почти не сталкивался - а тут оказалось нужно заказать оборудование, да еще сразу под полупрепаративный вариант. В методике которую дали на освоение толком ничего не описано - манагеры из аджилента уже хватаются за сердце - когда я им лезу со своими безумными прожектами. спасибо еще раз колоночку поменьше для отработки метода обязательно куплю |
||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
||
|
trace Пользователь Ранг: 69 |
05.04.2013 // 18:31:53
Редактировано 2 раз(а) Посмотрите здесь |
||
|
epanchintsev Пользователь Ранг: 14 |
05.04.2013 // 18:57:22
спасибо думаю только самостоятельно сконструировать девайс, который бы работал при давлении и объемах в 100 раз больших, чем аппарат представленный по приведенной ссылке -дело сверхсложное - обратите внимание - что в такой петле внутри должен быть подвижный поршень (чтобы избежать размывание/разбавление образца |
||
|
Волгин VIP Member Ранг: 1327 |
05.04.2013 // 20:07:08
Так там описана петля объемом 5 (пять) мл, а топикстартеру нужно вводить 200 (двести!) мл. Какую колонку Вы предложите? Тогда подумайте, не приобрести ли маленький насосик специально для введения пробы. Скажем, К120 от Кнауэра, или что-то подобное. И вообще, если Вы в Москве, свяжитесь со мной, может подъедете, вместе подумаем над вариантами. |
||
|
cholesterol Пользователь Ранг: 109 |
06.04.2013 // 22:59:37
Хотел внести свои 5 копеек к ответу Юры Волгина. 1) Если pH исходной смеси 6 и выше имеет смысл помимо добавления ацетонитрила подкислить до pH=4-5. 2) После того как нанесете раствор белка обязательно промойте колонку буфером не содержащим соль, т.к. при элюировании в градиенте от 30 до 80% ацетонитрила высок риск выпадения неорганических солей. |
||
|
Serga Пользователь Ранг: 1806 |
07.04.2013 // 6:44:10
Редактировано 1 раз(а) Тут все неправильно изначально. Зачем для очистки белка использовать системы ВЭЖХ, если для этого существуют специальные варианты FPLC (та же хроматография гидрофобных взаимодействий)? Приемы работы давно отработаны до мелочей. Агилент, Термофинниганы, Шимадзы и прочий народ на этом не специализируются. (Потому у них моск вскипел ).Обратитесь в компанию GE Healthcare (бывшая LKB Pharmacia и т.д.), в московии есть русский бранч, очень приличные спецы, русскоговорящие сотрудники, они мгновенно подберут всю необходимую аппаратуру и буклеты. Нефиг изобретать велосипед и гонять белки на неприспособленном для этих целей ВЭЖХ. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 25
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
