Форумы ANCHEM.RU: Нужно "вытащить" ион цинка из белка, какой хелатор посоветуете?

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

Нужно "вытащить" ион цинка из белка, какой хелатор посоветуете? >>>

  Ответов в этой теме: 18
  Страница: 1 2
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Автор

Тема: Нужно "вытащить" ион цинка из белка, какой хелатор посоветуете?

peroxid
Пользователь
Ранг: 4

07.11.2008 // 1:09:55

Редактировано 1 раз(а)

Здравствуйте уважаемые форумчане!

Я биохимик, с комплексонами сталкиваюсь не так часто и поэтому решил обратиться к вам за советом. Задачи поставлены следующие: есть протеолитический фермент, предполагаем, что в активном центре у него "сидит" цинк.
1)Попробовать ингибировать фермент каким-нибудь хелатором специфичным к иону цинка.
2)Нужно его оттуда извлечь, получив таким образом фермент без иона металла, ну а потом попробовать реактивировать добавлением металла в раствор (после диализа и удаления хелатора).

Соответственно и требования к хелаторам:
Для задачи 1
1.Хелатор нужен специфичный к иону цинка - чтобы доказать что там именно он, а не другой металл.
2.Желательно, чтобы хелатор был растворим в воде или в ДМСО/ДМФА - реакции гидролиза субстрата проводятся в водном растворе или с добавление ДМСО.
4. Работать при pH 7-8, так как в кислой области фермент быстро дохнет
3.Хелатор должен быть неокрашен или слабо окрашен в области 405 нм - при этой длине волны поглощает хромогенная группа субстрата нашего фермента.

Для задачи 2

Опять-таки специфичность, водорастворимость и работа при pH 7-8.

Пробовали использовать ЭДТА и ортофенантролин и цинкон, но пока безуспешно - ЭДТА и ортофенантролин ингибирует плохо (цинк очень крепко сидит?), а цинкон окрашен как раз в той области, в какой поглощает и хромогенная группа субстрата. Если поглощение около 3 опт. ед, я думаю определять изменение концентрации паранитроанилина бессмысленно?

Нашел в интернете следующие варианты:
1. diethyldithiocarbamate (DEDTC)
2. TPEN (N,N,N’,N’-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine)
3. DMPS (2,3-Dimercapto-1-propanesulfonic acid)

Не сталкивались ли вы при работе с этими хелаторами? Какой из них можете посоветовать?

Заранее спасибо за помощь!

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

07.11.2008 // 1:59:49

А почему бы напрямки не индицировать цинк в белке? SEC-ICP-MS, например. С PAGE и LA-ICP-MS будет сложнее - цинк вымывается даже в нативном варианте, но можно попробовать с трицином. В принципе, я видел слабый сигнал цинка при LA-ICP-MS-сканировании SOD-фракции на мембране после SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, но цинк - это такая бяка, которая лезет отовсюду. Надо будет в "чистой комнате" перепроверить, чтобы исключить артефакт.

peroxid
Пользователь
Ранг: 4

07.11.2008 // 9:06:07

bf109xxl пишет:
А почему бы напрямки не индицировать цинк в белке? SEC-ICP-MS, например.

Это конечно тоже надо сделать, но хелаторы хотим использовать еще и для того, чтобы заменить цинк на ион другого меалла и проверить после этого активность. В принципе это делают, с ортофенантролином, но наш фермент к нему почему-то невосприимчив (хотя о том, что в активном центре именно цинк говорят косвенные данные).

По поводу ICP, не скажите, где в Москве это можно сделать и сколько примерно будет стоить? Пока на ум приходит только "АНО "Центр биотической медицины" (microelements.ru)/

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

07.11.2008 // 11:37:10

peroxid пишет:
Это конечно тоже надо сделать, но хелаторы хотим использовать еще и для того, чтобы заменить цинк на ион другого меалла и проверить после этого активность.

Как-то мне сложно представить, что металл можно так запросто вытащить, не нарушая структуру активного центра. Есть уже такие примеры в литературе?

По поводу ICP, не скажите, где в Москве это можно сделать и сколько примерно будет стоить? Пока на ум приходит только "АНО "Центр биотической медицины" (microelements.ru)/

В Москве - не знаю. Мы располагаемся несколько западнее. Но занимаемся именно этой проблематикой - металл- и металлоидсодержащими белками. Достаточно неплохо оснащены оборудованием. Можем оказать содействие в рамках научной кооперации.

Волгин
VIP Member
Ранг: 1326

07.11.2008 // 12:20:46

Дурная мысль в голову пришла. Если не в тему, не бейте больно!

В "БиоХимМаке СТ" делают сорбент с иммобилизованной иминодиуксусной кислотой. Может пропустить через него (или колонку с ним) раствор Вашего белка в подходящем элюенте?

ukvukv
Пользователь
Ранг: 134

07.11.2008 // 14:17:44

Редактировано 1 раз(а)

peroxid пишет:
...Задачи поставлены следующие: есть протеолитический фермент, предполагаем, что в активном центре у него "сидит" цинк.
Для задачи 1...

Доброго Вам, peroxid!
М.б. лучше для задачи №1 определить наличие точно цинка в активном центре. Поставте качественную реакцию на цинк.
А имя у фермента есть?

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Лаборатория аналитического контроля ЗАО "РРЭЦ"
Проведение количественного химического анализа проб грунтового воздуха с территории распространения техногенных газогенерирующих грунтов газохроматографическим способом

Ян
Пользователь
Ранг: 15

07.11.2008 // 14:37:21

Имеет смысл попробовать следующее. Ставите гидрофобную хроматографию - вам нужны условия и носитель, где можно обеспечить как 100%-ое связывание, так и последующую количественную элюцию. Сажаете белок, промываете большим количеством комплексообразующего агента, затем смываете. Соответственно, поглощение комплексона роли не играет. В частности, подобным образом удобно удалять особо прочно связанные конкурентные ингибиторы - и, кажется, что и удаление металла так тоже можно провести.
Т.е. это как бы "обращенный" вариант того, что предложил Волгин.

hongma
Пользователь
Ранг: 9

07.11.2008 // 14:37:25

peroxid пишет:
Здравствуйте уважаемые форумчане!

Я биохимик, с комплексонами сталкиваюсь не так часто и поэтому решил обратиться к вам за советом. Задачи поставлены следующие: есть протеолитический фермент, предполагаем, что в активном центре у него "сидит" цинк.
1)Попробовать ингибировать фермент каким-нибудь хелатором специфичным к иону цинка.
2)Нужно его оттуда извлечь, получив таким образом фермент без иона металла, ну а потом попробовать реактивировать добавлением металла в раствор (после диализа и удаления хелатора).

Соответственно и требования к хелаторам:
Для задачи 1
1.Хелатор нужен специфичный к иону цинка - чтобы доказать что там именно он, а не другой металл.
2.Желательно, чтобы хелатор был растворим в воде или в ДМСО/ДМФА - реакции гидролиза субстрата проводятся в водном растворе или с добавление ДМСО.
4. Работать при pH 7-8, так как в кислой области фермент быстро дохнет
3.Хелатор должен быть неокрашен или слабо окрашен в области 405 нм - при этой длине волны поглощает хромогенная группа субстрата нашего фермента.

Для задачи 2

Опять-таки специфичность, водорастворимость и работа при pH 7-8.

Пробовали использовать ЭДТА и ортофенантролин и цинкон, но пока безуспешно - ЭДТА и ортофенантролин ингибирует плохо (цинк очень крепко сидит?), а цинкон окрашен как раз в той области, в какой поглощает и хромогенная группа субстрата. Если поглощение около 3 опт. ед, я думаю определять изменение концентрации паранитроанилина бессмысленно?

Нашел в интернете следующие варианты:
1. diethyldithiocarbamate (DEDTC)
2. TPEN (N,N,N’,N’-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine)
3. DMPS (2,3-Dimercapto-1-propanesulfonic acid)

Не сталкивались ли вы при работе с этими хелаторами? Какой из них можете посоветовать?

Заранее спасибо за помощь!

Здравствуйте
Если ЭДТА не ингибирует /кстати, а какие концентрации? попробовать напихать побольше?/ - навряд ли это вообще металлопротеиназа

Можно попробовать диализ против раствора ЭДТА около 0,1-0,2 М на 24-48 ч. Это выковырнет ЛЮБОЙ цинк.
Цинк стоит напрямую померить в ферменте /лучше после его денатурации/.
И, наконец, проверьте с йодуксусной кислотой и изопропилфосфатом - тест на тиоловые и сериновые протеиназы.
До свидания

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

07.11.2008 // 14:47:52

Что то сомневаюсь я: чтобы EDTA и цинк из фермента не вынула?! Как же он там сидеть то должен...

Т.е. EDTA активность вообще не уменьшает, или уменьшает но не на 100%?

Фермент более -менее очищенный, или crude preparation? T.e насколько специфичен выбранный сусбтрат?

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

07.11.2008 // 15:18:28

Волгин пишет:
Дурная мысль в голову пришла. Если не в тему, не бейте больно! В "БиоХимМаке СТ" делают сорбент с иммобилизованной иминодиуксусной кислотой. Может пропустить через него (или колонку с ним) раствор Вашего белка в подходящем элюенте?

А в таком варианте происходит удаление металла из белка?

bf109xxl
Пользователь
Ранг: 1727

07.11.2008 // 15:20:02

Spectrometrist пишет:
Что то сомневаюсь я: чтобы EDTA и цинк из фермента не вынула?! Как же он там сидеть то должен...

Цинк в той же Cu,Zn-SOD сидит очень прочно, если не происходит денатурации.


Ответов в этой теме: 18 Страница: 1 2 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты