Возможности оценки мембранной активности тромбоцитов с помощью лазерного анализатора микрочастиц «ЛАСКА-БИО». Значение для клинико-лабораторной гемостазиологии

Тезисы VII конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2004" »
Стендовые доклады » Стендовая Секция V. Анализ биологических, медицинских и фармацевтических объектов » ...

Возможности оценки мембранной активности тромбоцитов с помощью лазерного анализатора микрочастиц «ЛАСКА-БИО». Значение для клинико-лабораторной гемостазиологии

Стуров В.Г.¹, Шорина Г.Н.¹, Миндукшев И.В.²

1 Государственная медицинская академия, Новосибирск, Россия. Е-mail: cosmeticmedin.nsc.ru

2 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия. Е-mail: rootdef.mail.iephb.ru

В современной гемостазиологии доминируют тромбогеморрагические состояния и синдромы. Изменение функциональной активности тромбопластин-содержащих (ТФ) клеток (тромбоцитов, эритроцитов и др.) играют ключевую роль в механизмах, обеспечивающих гомеостаз, а также в патогенезе любого патологического процесса. В частности, повышение их чувствительности к рецепторным воздействиям с последующей дегрануляцией, высвобождением биологически активных веществ и вторичной активацией клеток микроокружения, регламентирует возрастание тромбогенного потенциала, который может создать угрозу возникновения не только локального, но диссеминированного тромбообразования. Актуальным являются проблемы достоверной аппаратной визуализации функциональной активности клеточной мембраны и эффективности внутриклеточного метаболизма.

В работе использовалась запатентованная методика оценки функционального состояния тромбоцитов с применением малоуглового светорассеивания, оцениваемого на приборе «Ласка-Био» НПФ АП «ЛЮМЕКС» ( Санкт- Петербург, Россия).

Источником ТФ-содержащих клеток служила богатая тромбоцитами плазма (PRP), полученная из цитратной венозной крови. Полученную PRP разбавляли в 80-100 раз в солевой среде (140 mM NaCI, 0.5 mM CaCI2 , 5 mM tris-HCI буфер с pH 7,8) с конечной концентрацией тромбоцитов 5-7*10⁹/л. Далее регистрировали динамику интенсивности малоуглового светорассеивания под углами 0-14°. Оценивалась спонтанная и индуцированную экзогенными (АДФ, тромбин, адреналин, фибрин-мономеры, коллаген, серотонин) и не физиологическими агонистами (ристомицин) агрегацию, дезагрегацию и коагулирующую активность тромбоцитов.

Программное обеспечение прибора позволило получить графическое изображение процесса клеточной активации и агрегации, визуализированного на угловой диаграмме (индикатрисе). Количественная характеристика статуса тромбоцитов основывалась на оценке величин: ЕС-50 - концентрации индукторов агрегации, необходимой для достижения половины максимальной скорости агрегации, Umax - нормированной (по концентрации клеток) максимальной скорости агрегации, а также С- концентрации клеток в единице объема (1 мкл).

В ответ на повышение внутриклеточной концентрации кальция, активируется аденилатциклаза, и при отсутствии дополнительного стимула, необходимого для ее угнетения, клетки переходят в рефрактерное состояние. Было показано, что для развития рефрактерного состояния достаточно только активации клеток. Были оценены временные константы (k) и периоды полуразвития рефрактерного состояния (t_1/2). Можно предположить, следующий сценарий процесса. В ответ на повышение внутриклеточной концентрации кальция, активируется аденилатциклаза, и при отсутствии дополнительного стимула, необходимого для ее угнетения, клетки переходят в рефрактерное состояние. Нарушение в процессе развития рефрактерности может быть одной из причин развития массового тромбоза.

При диагностике геморрагических состояний акцент в оценке тромбоцитарной активации строится на изучении кинетики агрегационного каскада, индуцированного мембранными (АДФ, адреналин, тромбин) и контактными (коллаген, фибрин-мономеры, ристомицин) индукторы. Оценивается скорость нарастания агрегационной волны, индекс светопропускания на ранней стадии, определяющей степень насыщения рецепторов мембранных гликопротеинов тромбоцитарной мембраны экзогенными агонистами. Кроме этого, по линейности индикатрисы (амплитуде I и II волны) судят об эффективности внутригранулярной генерации тромбоксана А₂ и реакции высвобождения содержимого гранул хранения, являющихся одним из ранних маркеров предтромботического статуса. Исследуемые параметры позволяют дифференцировать различные патогенетические варианты тромбоцитарной дисфункции. При нередком сочетании тромбоцитопатий с мезенхимальной дисплазией выявляются аномалии взаимодействия тромбоцитов с фибрин-мономерами. На примере оценки статуса тромбоцитов в эксперименте и при исследовании коагулологической патологии, проявляющейся как тромботическим, так и геморрагическим синдромами продемонстрированы преимущества вышеуказанного метода для оценки функционального состояния ТФ- содержащих клеток.