Форумы ANCHEM.RU: масс-спектры

Российский химико-аналитический портал

химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов

карта портала ::: расширенный поиск

ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ...

Форум химиков-аналитиков, аналитическая химия и химический анализ.

масс-спектры >>>

  Ответов в этой теме: 34
  Страница: 1 2 3 4
  «« назад || далее »»

[ Ответ на тему ]

Олег
Пользователь
Ранг: 529

22.03.2007 // 16:38:15

Spectrometrist пишет:
Вообше ничего?! Ни кератина, ни трипсина , ни коллагена? Сколько МS/MS было в поиске? Что такое "результат покрашен зеленым" - это вы про МС, или МС/МС?

Второй вопрос: это была полоса с геля? или вы делали digest в растворе? Это (как вы думаете) был индивидуальный протеин, или цложный экстракт, т.е вы ожидали много белков?

Исследовал экстракт. Его делил на сефадексе, потом ВЭЖХ и отдельные фракции на ТСХ. Последние и отдавал на анализ, полагаю вещество дожно быть довольно индивидуальным. По крайне мере некоторые фракции ТСХ. Зеленый цвет для мс/мс, как мне объяснили - значит достоверность плохая. Тоже и на de Novo - score в основном 10. Можно посмотреть:www.bioinformaticssolutions.com/products/peaks/download.php
На ТСХ вещество окрашивается нингидрином. Полагаю - пептид. Судя по массе короткий.

ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

22.03.2007 // 16:55:46

ОК, еще теплеe:

а digest делали (пептид то короткий?!), или он прямо шел в масс спек? Если делали, то чем? Трипсином?

Я уже спрашивал, но все равно: сколько МС/МС посылали в mascot search?

Олег
Пользователь
Ранг: 529

22.03.2007 // 17:04:08

Spectrometrist пишет:
ОК, еще теплеe:

а digest делали (пептид то короткий?!), или он прямо шел в масс спек? Если делали, то чем? Трипсином?

Я уже спрашивал, но все равно: сколько МС/МС посылали в mascot search?

Нет не делали прямо на масс спек.
Посылал несколько и в разных вариантах 1, 1-3 зарядный.
Если это Вы мне прислали статью Певцова, то я на этот адрес выслал несколько результатов.

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

22.03.2007 // 17:37:39

Не допираю: digest делали или НЕ делали?

Сколько спектров посылали в Маскот?

Статей не посылал.

Олег
Пользователь
Ранг: 529

23.03.2007 // 10:11:34

Редактировано 2 раз(а)

Spectrometrist пишет:
Не допираю: digest делали или НЕ делали? - Нет не делали

Сколько спектров посылали в Маскот? - 14

Каталог ANCHEM.RU
Администрация
Ранг: 246

АналитПро, ООО
Комплексное оснащение химико-аналитических и испытательных лабораторий. Консалтинг, информационное и научно-техническое сопровождение поставок лабораторного и аналитического оборудования. Комплектация лабораторий, подбор методик и оборудования.

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

23.03.2007 // 11:29:42

Теперь все более-менее встало на места. Проблема database search' а здесь вторичная, вначале нужно точно понять с каким пептидным материалом вы имеете дело, а потом спланировать, как фрагментировать и где искать.

Чего бы я сделал:

1. 10 % < материала (эктрагированной полосы с ТСХ?)пустить на MALDI и посмотреть, что там есть (просто интактные массы) - сколько их, какие они точно, много ли там материала (МАЛДИ очень чувствительный метод, 5 % вам хватит за глаза. Принадлежит ли пик пептиду нужно проверить по изотопчому распределению

2. В зависимости от того, что покажет МАЛДИ, выберете варианты:
- LC MS/MS с массами в incusion list (посчитаете на 2+ и 3+, учтите что спектр с 3+ практически бесполезен для de novo)

- direct infusion и долбите precursor(с) пока не получите спектры отличного качества (лучше не делать на ion trap)

- если длинный пептид (> 15 аа, предположительно) надо делать дериватизацию по Keough et al (могу потом дать ссылки) и идти на МАЛДИ TOF/TOF (вроде, есть в ИБХ в МОскве)

Грузить непонятный образец на LC /MS с ion trap (да еще Агилент) довольно бессмысленно по многим причинам. Это хорошо для "стандартной" протеомной задачи, т.е: известные белки (т.е. те кот в датабазе) -> триптический digest -> poisk Маскот'oм: шаг влево, шаг враво и ваши шансы на нуле

Олег
Пользователь
Ранг: 529

23.03.2007 // 14:03:53

1. 10 % < материала (эктрагированной полосы с ТСХ?)пустить на MALDI и посмотреть, что там есть (просто интактные массы) - сколько их, какие они точно, много ли там материала (МАЛДИ очень чувствительный метод, 5 % вам хватит за глаза. Принадлежит ли пик пептиду нужно проверить по изотопчому распределению
- Научите пожалуйста.
Малди делал. Судя по спектру максимальная масса 1106, но похоже она от матрицы. Так что пептид короткий. Почти на всех спектрах есть. Цифры масс точно не совпадают, но порядок похож с данными мс-мс 500-700. Правда не все понятно, но уж больно мого писать формат форума не выдержит

Анализировал на esi-trap.
А как это делать - долбите precursor(с)? Чуть подробнее...
Спасибо.

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

23.03.2007 // 17:40:23

Редактировано 1 раз(а)

Простой и грязный способ: взять (любой) пептид похожей массы без Met и Cys и грубо сравнить с изотопными отношениями вашего пика-кандидата (елси вы посмотрите на пептидную карту любого гидролизата, вы увидите что изотопные отношения (как меряет их МАЛДИ) примерно похожи для пептидов похожего МW. Если ваш пик выгядит иначе, это должно насторожить.

Второе на что нужно сразу посмотреть, это что у него в моноизотопной массе после запятой: опять,же грубо, посмотрите что должно быть у пептидов похожего МW. Навскидку, в районе МW 1102 в десятичных должно быть что-то около 0.5, т.е. 1102.5ХХ, а вот у кластеров матрицы (как я помню) должно быть 0.2 или даже меньще - я поищу статью, где то они все описаны.

"Так что пептид короткий. Почти на всех спектрах есть. Цифры масс точно не совпадают, но порядок похож с данными мс-мс 500-700"

Не понял. Совпадение масс должно быть точным, на то это и масс спек. Что такое 500-700 - это интактная масса? Тогда пептид должен быть 5-6 аминокислот, это очень мало даже в идеальном раскладе для идентификации по гомологии.

Вы видите точно эту массу как 1+ / 2+ в LC/MS (сделайте ТIX). Эту массу фрагментировали? Если нет, поставьте массу одно и дву- зарядника в inclusion list, так чтобы не потерять.

"Долбить" по массе: вы можете вводить в масс-спектрометр вашу смесь напрямую, без LC например чере nanospray source. Тогда (поскольку вам не надо гонятся за всеми пиками) вы можете снимать МС/МС с вашей массы пока проба не кончится и, меняя colliion energy, добится качественного спектра

Вы также можете этерифицировать часть пробы и пальнуть по пику полнстью этерифицированного пептида. Сопоставляя спектры, можно надежнее читать сиквенс (для триптических пептидов это вообще классно работает).

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

23.03.2007 // 20:55:14

Перечитал и увидел что ответ не полный. Де ново должно пептид в 5-6 аа делать легко, но учтите что практически все программы заточены под триптические пептиды. Т.е. вы можете сказать программе что ваш пептид НЕ триптический, но такие сиквенсы программа будет делать хуже, не тому ее учили

Но, если Маскот этот пептид не нашел (кстати, а зачем его посылать с разными зарядами? - посмотрите, есть ли в МС/МС интенсивные ионы тяжелее прекерсора, еслли нет - то это 1+), - проверьте, была ли отключена специфичнисть фермента!!, то в точности такого сиквенса скорее всего нет в датабазе. Тогда берите все варианты (даже, какие они там, зеленые?) с де ново и идите в MS BLAST (link я давал).

Если и это не пройдет, надо а) бороться за качество спектра (см выше) и б) делать дериватизацию, хотя бы эстерификацией

Удачи!

Spectrometrist
Пользователь
Ранг: 777

26.03.2007 // 16:22:47

Обещанная ссылка на массы кластеров матрицы в МАЛДИ:

Harris, W. A., Janecki, D. J., and Reilly, J. (2002). Use of matrix clusters and trypsin autolysis fragments as mass calibrants in matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer. Rapid Comm Mass Spectrom 16, 1714-1722.


Ответов в этой теме: 34 Страница: 1 2 3 4 «« назад \|\| далее »»	Ответ на тему

ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ ANCHEM.RU: [ Все новости ]

Размещение рекламы / Контакты