| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Колонка после недельного простоя - что с ней происходит? >>>
|
 |
|
ukvukv Пользователь Ранг: 134 |
 11.10.2019 // 19:45:31
Редактировано 7 раз(а) Всем доброго дня! И так. Колонка Agilent Eclipse XDB-C18, 3,5 мюм 2,1×100 мм, предколонка С-18. Фаза А - чистая вода, изначально 18 мегаОм. Воды много, меняю часто. Formic, аммоний, буфера, азиды и пр. не добавляю - всё прорастает и цветёт, если не бактериями, то грибы точно. Напомню, систему пока запускаю раз в неделю. Фаза В - 100% ACN. Автосамплер - 25 мкл. Промывка иглы снаружи и после закола в 100% АСN. Штатив с пробами на термостате +10 град С. Поток - 0,2 мл. Термостат колонки + 30 град С. УФ - 230 нм. Градиент: 0 мин А-85%，В-15%, к 20-ой мин А-5%，В-95%, до 30-ой мин постоянно А-5% и В-95%， с 30-ой сразу опускаю до начальных А-85% и В-15%. Посттайм 10 мин. и новый закол. Это скажем так методика для собственно анализа. В последовательности анализов последняя методика заключительная: закол 100% АСN, фаза только В-100% ACN. Поток 0,2 мл, время 30 мин. Таким образом после серии заколов капилляры после насоса и колонка отмываются и заполняются на консервацию 100% АСN. Начало работы: 100 % ACN 15 мин до выхода на плато, а затем 15 мин фазы А-85% и В-15%，т.е. как перед запуском методики для анализа. Первый закол холостой вообще 100% ACN. Второй закол - сывороточный контроль с известным содержанием искомого вещества. На времени выхода - пика нет. Третий закол - опять контроль. Появляется какой-то горбылёк перед ожидаемым временем удерживания. Четвёртый закол - опять контроль. И наконец появляется пик искомого вещества и определяется заданная концентрация. Причём калибровку делал аж чуть ли не год назад. Пробоподготовка: осаждение белков сыворотки/эдта-плазмы 100% ACN, центрифуга 3000g и супернатант в закол. Уф, понаписал-то сколько. Но наверняка вопросов ещё от Вас будет много! И естественно жду критики. |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
SergeyK Пользователь Ранг: 2168 |
11.10.2019 // 20:40:36
Редактировано 2 раз(а) На правах гадалки: Ацетонитрил в игле после промывки испаряется за время простоя, вы вкалываете воздух. Пока он не выйдет, будет плохо. Выходит он за два-три закола. А вы зачем первым холостым более сильный элюент (100% ACN) вкалываете? |
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1337 |
11.10.2019 // 21:18:22
Редактировано 1 раз(а) Главное забыли: название определяемого вещества. Ладно, если оно секретное, то назовите его примерную молекулярную массу, скажите что-нибудь о его природе (функциональных группах), напишите его время удерживания (до 20 мин? от 20 до 30 мин?). С 20 по 30 мин идет просто отмывка колонки от грязи или там элюируется что-то нужное? Вообще такое бывает. В колонке имеется некоторое количество адсорбционно-активных центров, с которыми некоторое вещество сильно взаимодействует. Когда колонка чистая (обычно это касается новых, не использовавшихся колонок), вещество из вводимых проб будет прочно связываться с активными центрами до их полного насыщения (такое бывает с белками, ничего страшного в этом нет). Соответственно, площадь пика будет расти от нуля до постоянной величины. Далее идет обычная хроматография, в которой участвует уже менее активная поверхность сорбента, с воспроизводимыми результатами. Как вариант, в вашем случае чистый ацетонитрил полностью очищает колонку от определяемого вещества, после чего требуется ее насыщать. Немного смущает то, что в конце градиента ПФ и так довольно сильная (95% ACN). Посмотрите, что будет получаться, если колонку не промывать чистым ACN, а оставлять под 95% ACN или под 15% ACN. Посмотрите, что будет на нескольких последовательных хроматограммах контрольного раствора, если в конец программы градиентного элюирования добавить 15-30 мин на чистом ACN. Посмотрите, что будет, если в начале вашей обычной серии хроматограмм записывать не одну хроматограмму холостого раствора, а 2-3. По вашей методике замечу, что ввод 25 мкл пробы в чистом ACN при том, что начальная ПФ содержит всего 15% ACN, да с учетом небольшого объема колонки указанного размера чревато получением кривых (а то и двоящихся) пиков. Впрочем, если ваше вещество достаточно сильно удерживается, форма пика может быть приемлемой. |
|||||
|
ukvukv Пользователь Ранг: 134 |
11.10.2019 // 22:23:12
Редактировано 1 раз(а) 1. Как избежать вкалывания воздуха? Т.е. как оставлять иглу на неделю? За 3 повтора холостой пробы ситуация не изменялась. Только минимум три повтора опытной пробы "выгоняет воздух". Видимо в опытной пробе после осаждения белков есть ещё что-то, что способствует "гону воздуха". 2. Чисто интуитивно, чтобы смыть нечто, что будет мешать анализу. А Ваши рекомендации, что брать в качестве холостой пробы, разбавленный ACN?Мне видится, что 25 мкл холостой пробы в потоке 0,2 мл размажется. |
|||||
|
ukvukv Пользователь Ранг: 134 |
11.10.2019 // 22:57:15
Редактировано 5 раз(а) Мне казалось я ранее озвучивал - карбамазепин. А как это становиться главным? время удерживания 12 минута. Вначале идут какие-то пики где-то 2-5 мин или даже точнее их суммарный пик, интенсивность по высоте 120 ед., а на 12,3 мин идёт пик искомого вещества, с интенсивностью 40 ед. Хроматограмма почти чистая. Пик CBZ красивый, ни с чем не перекликается. Что ещё интересно. Начальные пики на 2-5 минуте идут во всех опытных пробах у всех пациентов, примерно в одном диапазоне 100-200 ед. И самое главное - эти пики идут и в во всех заколах контрольной пробы, т.е. пика CBZ нет, а эти пики есть и их интенсивность не меняется от закола. С 20 по 30 мин идет просто отмывка колонки от грязи? Да, во всяком случае я так решил для себя. По вашей методике замечу, что ввод 25 мкл пробы в чистом ACN... Белки сыворотки осаждаются ACN, а жидкая фаза сыворотки разводит в свою очередь ACN. Так что ACN разбавлен, хоть и в меньшей степени, чем в фазе. Но обязательно этот момент учту на будущее, благодарю. Когда колонка чистая (обычно это касается новых, не использовавшихся колонок) Увы, колонки достались в наследство от предыдущего пользователя. Выбрал эту колонку опять же чисто интуитивно и долго вначале отмывал. Посмотрите, что будет получаться, если колонку не промывать чистым ACN, а оставлять под 95% ACN или под 15% ACN. После газового хроматографа я так долго сопротивлялся закалывать в колонку жидкостника больше 5 мкл, а уж 25 мкл мне казалось просто чем-то запредельным, что преодолеть этот психологический барьер оставить колонку в 15 % ACN пока сложно. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1337 |
11.10.2019 // 23:53:18
Редактировано 1 раз(а) Какой воздух? Хроматограф, как я понимаю, Agilent. Там поток ПФ из насоса все время идет через иглу автосамплера, кроме пары минут, когда игла вынимается из своего седла и опускается в виалу, чтобы отобрать пробу. |
|||||
|
ukvukv Пользователь Ранг: 134 |
12.10.2019 // 0:00:48
SergeyK же сказал, что это на правах гадалки. Или может он имел ввиду что-то иное. |
|||||
|
ukvukv Пользователь Ранг: 134 |
12.10.2019 // 0:04:07
Сисадмины, подскажите, пожалуйста, как выкладывать картинки и в каком формате? На наглядных хроматограммах было бы гораздо информативнее и проще общаться. |
|||||
|
SergeyK Пользователь Ранг: 2168 |
12.10.2019 // 0:08:58
Я попутал, воздуха там не будет. |
|||||
|
vmu Пользователь Ранг: 1337 |
12.10.2019 // 0:22:08
А если в начале (после холостого) колоть не сывороточный контрольный раствор, а стандартный раствор CBZ, на первой хроматограмме стандартного раствора тоже нет пика CBZ? |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 69
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
