| Российский химико-аналитический
портал |
химический анализ и аналитическая химия в фокусе внимания ::: портал химиков-аналитиков ::: выбор профессионалов |
 |
|
| ANCHEM.RU » Форумы » 1. Аналитический форум ... |
 |
Странности в ВЭЖХ, помогите разобратся >>>
|
 |
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
 10.02.2005 // 20:11:56
Эээ, батенька, так у Вас милихром? Колонки давно не snsychev забивает, так что... Сорбент у них сейчас хороший, а вот за остальные параметры не ручаюсь. Там ацетон из помойного ведра в сотую обратку могут запустить. Я бы колонку еще мыл и мыл. А первое, что надо сделать - холостой закол чистого буфера. Удачи! |
|||||
|
ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
||||||
|
Korvet Пользователь Ранг: 1114 |
10.02.2005 // 20:32:57
Угу, спасибо. Вообще планирую работать в изократике 50а-нитрил, 50-буфер с рН=3 (как и в те разы), ну колонку сперва промою минут 20 чистым а-нитрилом, посмотрю что из неё пойдёт, потом помаленьку на рабочий раствор перейду, первый конечно просто холостой ввод, потом буду запускать пробы 0,5мг\мл. раствор для разведения будет варьироваться от чистого буфера, до 50/50 с а-нитрилом. Как думаете нормальная стратегия? А что Вы так миллихром обижаете? Нормальная машинка, а колонка старая у нас до этого 2 года работала, сколько хроматограмм снято даже не могу так сразу сказать, может около 500. Не знаю, может это не много и колонка на самом деле не такая хорошая, сравнить то не с чем... |
|||||
|
G.Baram VIP Member Ранг: 211 |
10.02.2005 // 23:03:55
Редактировано 1 раз(а) Уважаемый Костя-Vip! Вы так много говорите, что кроме себя, похоже, никого не слышите. Прочитайте самый первый пост и начните думать сначала. Я уже предложил один раз свою помощь, предлагаю второй раз. Конечно, если была бы пропись подготовки образца и хроматограммы, то ответ был бы подкреплен расчетами. А так могу высказать лишь очевидное предположение. Исходные данные. Диазепам имеет рК 3.3. Пробу для ВЭЖХ готовили разбавлением 0.5% р-ра (видимо, раствор для инъекций, рН 7) фосфатным буфером с рН 3 (До какой концентрации? Концентрация буфера?). Что происходит сразу после инжекции? Мы имеем два сорта молекул в воде - ионы и неионы. Они имеют разную подвижность, а равновесие определяется рН раствора. Раствор постепенно (отнюдь не мгновенно)и неоднородно разбавляется подвижной фазой, что сопровождается сдвигом равновесия в сторону неионов (уменьшается диссоциация). Именно в этот "неравновесный" и "неоднородный" период происходит разделение молекул, которые из-за неоднородности зоны двигаются вдоль колонки с разной скоростью. Когда однородность достигнута, то все молекулы двигаются уже с одной скоростью, но те, которые убежали вперед, так и лидируют до конца. Подтверждение. Если разбавителем является метанол, то раздвоение пика уже существенно меньше. Так и должно быть - первичная неоднородность также существенно меньше. "Золотое" правило: "Не хочешь проблем, обеспечь одинаковость состава раствора для образца с составом подвижной фазы". Почему УФ спектры пиков в "дуплете" разные? Самое простое объяснение - пики выше 8-10 е.о.п., т.е. выпали за линейный диапазон детектора. Жаль, что нет хроматограммы. Если концентрацию диазепама в образце сделать 0.2 мг/мл и инжектировать 3-4 мкл, то все будет ОК. Кстати сказать, высокая концентрация диазепама в пробе процесс раздвоения пиков только усугубит. Еще одна причина аномального уширения или раздвоения водной зоны в ацетонитрильной подвижной фазе связана с аномальным механизмом смешивания воды и ацетонитрила. Он носит ярко выраженный мицеллярный характер. Диазепам, находящийся внутри водной мицеллы, удерживаться в первый момент не будет. Когда мицелла распадется, то все молекулы станут одинаковыми, но те, которые "провалились" будут лидерами до детектора. По-моему объяснил длинно, но ясно. Я двойной пик диазепама видел лишь однажды - примесь (около 25%) плохо отделялась. Когда "главный" пик рехроматографировал в той же системе, то все стало на свои места. Ветра в паруса, Корвет, и шесть футов под килем! Если рискнете проверить "золотое правило", то расскажите о результате, пожалуйста. |
|||||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
11.02.2005 // 4:18:29
С искажением и даже двоением пиков в результате закола в буфере с сильно отличающимся от подвижной фазы pH (особенно если ионная сила буфера пробы больше, чем у подвижной фазы) сталкивался многократно, гораздо чаще, чем с делением таутомеров, но не предполагал, что здесь может быть тот самый случай - сбило с толку утверждение о различии в УФ спектре. Если дело в банальной перегрузке детектора, то таутомеры, конечно, ни при чем. Насчет эффекта, связанного с аномальным перемешиванием - сомневаюсь, что при данном составе подвижной фазы он может играть заметную роль. Другое дело, при содержании ацетонитрила в подвижной фазе выше 80%. В этом случае доводилось наблюдать всякие фокусы, особенно если в пробе еще и солей хватает. Впрочем, очень многое зависит и от отношения объема пробы к сечению колонки. |
|||||
|
Леонид VIP Member Ранг: 5266 |
11.02.2005 // 10:07:22
Браво, Григорий Иосифович!   Рад лицезреть в нашем форуме! Действительно, в плане странностей при ВЭЖХ ларчик зачастую открывается очень просто. Не зря рекомендуется пробу вводить растворенной в элюенте. В противном случае каждый наблюдал много раз столько артефактов, что о их природе стоит только догадываться. А мы все в процессе обсуждения просто забыли один золотой принцип: ремонт любого прибора нужно начинать с проверки сетевой вилки, дабы не нарушить принцип "бритвы Окама" и не пытаться объяснить простое явление черезчур сложным образом. |
|||||
|
Каталог ANCHEM.RU Администрация Ранг: 246 |
|
|||||
|
G.Baram VIP Member Ранг: 211 |
11.02.2005 // 10:34:16
Редактировано 1 раз(а) Максимальная концентрация мицелл наблюдается именно при концентрации органики в элюенте около 50%. Именно из-за этого смеси 1:1 имееют наибольшую вязкость. Мицеллы особенно прочные, если смешивать органический растворитель с водой, которая содержит соль. А уж фосфат калия с ацетонитрилом - смесь особенно неприятная. Система вода-ацетонитрил многие годы изучается очень интенсивно, но реальных успехов пока нет. Сплошное наукообразие, малополезное для практики. |
|||||
|
albert Пользователь Ранг: 440 |
11.02.2005 // 11:47:38
Уважаемые посетители форума, помогите и мне до конца разобраться с моими проблемами. Мы наблюдаем схожие проблемы, но предпосылки другие: LC/MS/DAD/ELSD, высокоскоростной скрининг, короткие колонки 50мм на 4.6мм 5мкм, градиент от 0.1%TFA, 5%AcN, 95%H2O до 0.1%FTA, 100%AcN за 2.5мин, скорость потока 3.75мл/мин. Растворитель пробы: обычно DMSO или MeOH, вводимый объем 5мкл. Сильные основания, обычно гидрохлориды, изредка дают 2 разделенных вплоть до базы пика, первый из которых не удерживается. Для них повторяем полномасштабный анализ: колонка 250мм на 4.6мм, 5мкм, элюенты те же, но градиент за 12 мин, скорость потока 1.5мл/мин. Растворитель пробы: элюент "А". Два пика. Нагрузка по образцу небольшая. DAD в линейном диапазоне, максимумы прописаны четко, но для первого пика сдвинуты на 4-5нм в коротковолновую область (протон?). Масс-спектры обоих пиков идентичны. По данным ЯМР, электронного удара и элементника в-во чистое. После добавления в пробу TFA - один пик (задний). Иногда после добавления TFA нужно подождать полчаса - час, если этого не сделать, то можно наблюдать как первый пик от вкола к вколу постепенно начинает исчезать и перетекать во второй. Другой путь решения проблемы - ацетат амоннийный буфер, 20мМоль/л, но не всегда помогает. Сорбенты: Kromasil, Hypersil, Hypersil-BDS, Luna, Betasil, Zorbax, Chromolith - без разницы. Что самое интересное, раздвоения не наблюдается на сорбенте Hi-Q C18 (Peeke Scientific), независимо от длинны колонки и растворителя пробы. Меня мучает вопрос: возможно ли, что равновесие между ионом и "неионом" устанавливается так долго (даже при добавлении в пробу TFA!), что в процессе разделения они делятся "как есть", без каких-либо попыток перетечь из одной формы в другую? И почему на Hi-Q раздвоения нет? Колонка может работать от 100% воды, но этим сейчас никого не удивишь. |
|||||
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
11.02.2005 // 13:26:27
Уважаемый Григорий Иосифович! Говорить на форуме - это мое право, так же как и что-то слышать и думать. Тем более, что просьба выслать хроматограмму была адресована не мне. Упомянутый Вами эффект вполне может иметь место, особенно если учесть большой мертвый объем в начале милихромовской колонки. Однако, как заметил Евгений, сразу было сказано, что спектры веществ значительно отличаются. Опять же, насколько значительно - не знаю. Я все-таки придерживаюсь мнения, что с колонки (это мог быть и инжектор, но к милирому это вроде не относится) что-то моется чистым буфером. Такое тоже не раз проходили. Кроме того, зависимость вязкости системы вода-ацетонитрил принципиально отличается от зависимости для системы вода-спирт с максимумом при мольном отношении 1:1. Максимум вода-ацетонитрил находится при мольном соотношении примерно при 10% ацетонитрила. Я, правда, в свое время занимался изучением системы вода-диоксан методом ЯМР (по зависимостям хим. сдвига, скорости протонного обмена и релаксации). Там микроэмульсия начинает образовываться при 30-35% мольных воды, а до этого вода находится только в виде димеров. Результаты сочетаются с таковыми по ИК. К сожалению, пока некогда проверить эту теорию хроматографией. А вот в случае Альберта, кажется, работает именно указанный эффект. |
|||||
|
КонстантинС VIP Member Ранг: 2306 |
11.02.2005 // 14:21:46
..Дописываю.. С эффектами, описываемыми Альбертом, тоже сталкивался не раз. У Uwe Neue даже есть ряд статей по описанию этого эффекта, там есть технические советы как с ними можно бороться. С ним можно поговорить на форуме или поискать его работы в J.Chromat.A. Один ход могу привести из собственной практики. При больших вколах более 30 мкл бензпирена в 100% ацетонитриле наблюдал «растроение» пика адсорбата, хотя при вколе 10 мкл оставался лишь последний. Эффект начисто пропал при введении в пробу всего 2% воды, т.е. перерастворл в 98% ацетонитриле. Все это очень похоже на описанное Альбертом, и согласуется с исчезновением эффекта расщепления пиков полярных соединений на колонках с polar embedded group или polar endcapped. Все дело, видимо, в сочетании негомогенности пробы и фазового коллапса (это грубо, но можно назвать как угодно). Кстати, вряд ли при неравномерном разбавлении в обращенке стоит учитывать равновесие форм – при рН 7 в чистой воде характеристическое время установления равновесия – тысячная секунды, а при подкислении, к примеру, рН 3 – уже порядка десятимиллионной секунды. Автору. Я бы сначала на элюенте (пока не отмывая колонку!) пороколол чистый буфер, варьируя объем, от 1 мкл до 50, к примеру. Если появляется 2ой пик, и его площадь зависит об объема вкола – моется грязь. Тогда колонку надо промыть сначала чистым буфером, а потом ацетонитрилом. |
|||||
|
Islander VIP Member Ранг: 1065 |
11.02.2005 // 14:25:52
Правильно, но мы говорим об эффектах динамических, происходящих при смешивании пробы с элюентом. Если водную пробу закалывать в 50% ацетонитрил, то в зоне смешивания концентрация будет изменяться от 0 до 50%. А если в 80%-ный, то в этой зоне она как раз пройдет через максимальное мицеллообразование. Впрочем, как Вы правильно отметили, добавка соли, в особенности фосфата влияет катастрофически и очень сильно затормаживает смешивание в системах с ацетонитрилом. |
| |
||
|
Ответов в этой теме: 146
|
||
| ЖУРНАЛ | ЛАБОРАТОРИИ | ЛИТЕРАТУРА | ОБОРУДОВАНИЕ | РАБОТА | КАЛЕНДАРЬ | ФОРУМ |
| Copyright © 2002-2022 «Аналитика-Мир профессионалов» |
|
Размещение рекламы / Контакты |
[]
